Identifikasjon av mikroRNA involvert i cerebral collateral regulering (microRNA)

Pasienter i alderen >18 år som oppsøker akuttmottaket ved Ohio State University (OSU) Wexner Medical Center med akutt iskemisk hjerneslag vil bli screenet. Utforskerne vil inkludere pasienter med akutt iskemisk hjerneslag i fremre sirkulasjon sekundært til plutselig akutt storkarokklusjon (LVO). Friske forsøkspersoner vil bli brukt som kontroller for å vurdere miRNA-er som er spesifikke for slagpopulasjonen. Siden hemodynamisk signifikant eksisterende stenose kan resultere i endring av miRNA-ekspresjon, vil etterforskerne ekskludere pasienter med >50 % stenose av den indre halspulsåren (ICA), >50 % stenose av bilaterale vertebrale arterier samt pasienter med moderat til alvorlig intrakraniell aterosklerotisk sykdom som vist i CT-angiogram (CTA) av hode og nakke. For å minimere konfounders vil pasienter med kjent moderat til alvorlig perifer vaskulær sykdom eller symptomatisk koronararteriesykdom med tidligere stent eller koronar bypassgraft også bli ekskludert. Fanger og gravide vil også bli ekskludert fra denne studien. Differensiell ekspresjon av eksosomal mikroRNA hos pasienter med akutt LVO sammenlignet med friske kontroller vil bli evaluert. I tillegg vil en nevroradiolog gradere den cerebrale kollaterale sirkulasjonen som (i) god eller (ii) dårlig, etter nøye gjennomgang av CTA- og CT-perfusjonsstudier (CTP) hos hver pasient ved bruk av validert collateral scoring-metode. Tretti pasienter med okklusjon av store kar vil bli inkludert i denne studien i tillegg til 15 friske kontroller (n=45). Blodprøver vil bli tatt på 4 forskjellige tidspunkt fra symptomdebut for hver pasient: (i) 0-6 timer, (ii) 6-12 timer, (iii) 12-24 timer og (iv) 5-7 dager. Differensiell MiRNA-uttrykk vil også bli evaluert mellom pasientene med varierende kollateralgrad

Siden prosessen med kollateral modning sannsynligvis begynner kort tid etter hemodynamiske endringer indusert av LVO, planlegger etterforskerne å samle den første prøven innen 0-6 timer. Tre blodprøver vil bli samlet i løpet av de første 24 timene for å øke sjansene for å fange opp miRNA-ekspresjonsprofilen i begynnelsen av den sideordnede remodelleringsprosessen. miRNA-profiler av disse pasientene vil deretter bli analysert og sammenlignet med friske frivillige. I tillegg vil det bli gjort sammenligning mellom pasienter med god og dårlig cerebral kollateralgrad. Vi vil analysere miRNA-profilene til disse pasientene ved hjelp av metoder beskrevet nedenfor.

Eksosomisolering og karakterisering: Kvantifisering av eksosomnummer og størrelse vil bli utført ved å bruke en NanoSight NS300 (Nanosight, UK) ved OSU CCC Analytical Cytometri Core som tidligere beskrevet. Kort fortalt vil eksosomer bli isolert fra cellefritt plasma ved hjelp av Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Eksosomer vil bli suspendert i PBS-buffer og lagret ved 4°C i opptil 7 dager. Eksosomsuspensjonen vil deretter fortynnes for å oppnå en arbeidskonsentrasjon mellom 2 x 108 - 8 x 108 for bruk i NanoSight NS300, hvoretter eksosomer vil telles og dimensjoneres11.

Total RNA-isolering: Totalt RNA vil bli isolert fra eksosomer suspendert i PBS ved å bruke det sirkulerende nukleinsyreekstraksjonssettet (Qiagen) som tidligere beskrevet12. DNA-kontaminering vil reduseres ved bruk av Qiagens RNase-frie DNase-sett. RNA vil bli konsentrert og renset ved hjelp av RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) som beskrevet.

NanoString Assay: Det multipleksede nanoString nCounter miRNA-systemet (nanoString Technologies) ved Ohio State University CCC Genomics Shared Resource vil bli brukt til miRNA-ekspresjonsprofilering som beskrevet12. Totalt RNA (100ng) isolert fra eksosomer vil bli brukt som inputmateriale. Små RNA-prøver vil bli forberedt ved å ligere en spesifikk DNA-tag på 3'-enden av modne miRNA-er i henhold til produsentens instruksjoner (nanoString Technologies). Disse taggene vil normalisere smeltetemperaturene til miRNA-ene og gi identifikasjon for hver miRNA-art i prøven. Overskytende tagger vil bli vasket bort, og det resulterende materialet hybridisert med miRNA: tag-spesifikke nCounter-reporterprober. Hybridiserte prober vil deretter bli renset og immobilisert på en streptavidin-belagt patron ved bruk av nCounter Prep Station (nanoString Technologies). nCounter Digital Analyzer vil bli brukt til å telle individuelle fluorescerende strekkoder og kvantifisere miRNA-molekyler som er tilstede i hver prøve.

miRNA Expression Profile Normalization and Analyser: Kvalitetskontroll, normalisering og dataanalyser vil bli utført ved bruk av nSolver 2.0 Analysis Software (nanoString Technologies) som tidligere beskrevet. Hierarkisk klynging av miRNA-er identifisert gjennom nanoString-spørringen vil bli utført ved hjelp av dChip (v 1.3) programvare. Differensielt uttrykte miRNA-er hos pasienter med gode eller dårlige kollateralskårer (som beskrevet ovenfor) vil bli definert av en større enn eller mindre enn 2 ganger endring ved bruk av enveis variansanalyse (ANOVA)-analyse med et signifikansnivå på p<0,05 og med korreksjon for falsk oppdagelsesrate.

RT-PCR-validering av eksosomale miRNAer: Utvalgte miRNA-er isolert fra eksosomer vil bli reverstranskribert ved bruk av miRCURY LNA Universal cDNA-syntesesettet (Exiqon) i henhold til produsentens protokoll som beskrevet tidligere. miRNA-er vil bli kvantifisert ved sanntids-PCR ved bruk av ExiLENT SYBR Green (Exiqon) på en Mx3000P qPCR-plattform, med uttrykk normalisert til en husholdningsreferanse (dvs. SNORD44).