Identificación de microRNAs involucrados en la regulación colateral cerebral (microRNA)

Se examinarán los pacientes mayores de 18 años que se presenten en el Departamento de Emergencias del Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio (OSU) con accidente cerebrovascular isquémico agudo. Los investigadores incluirán pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo de la circulación anterior secundario a una oclusión aguda repentina de grandes vasos (LVO). Los sujetos sanos se utilizarán como controles para evaluar los miARN específicos de la población con accidente cerebrovascular. Dado que la estenosis preexistente hemodinámicamente significativa puede dar lugar a una alteración de la expresión de miARN, los investigadores excluirán a los pacientes con >50 % de estenosis de la arteria carótida interna (ACI), >50 % de estenosis de las arterias vertebrales bilaterales, así como a los pacientes con enfermedad aterosclerótica intracraneal de moderada a grave. como se ve en el angiograma CT (CTA) de la cabeza y el cuello. Para minimizar los factores de confusión, también se excluirán los pacientes con enfermedad vascular periférica conocida de moderada a grave o enfermedad arterial coronaria sintomática con antecedentes de stent o injerto de derivación de arteria coronaria. Los reclusos y las mujeres embarazadas también serán excluidos de este estudio. Se evaluará la expresión diferencial de microARN exosómicos en pacientes con LVO aguda en comparación con controles sanos. Además, un neurorradiólogo calificará la circulación colateral cerebral como (i) buena o (ii) mala, después de revisar cuidadosamente los estudios de perfusión CTA y CT (CTP) en cada paciente utilizando un método de puntuación colateral validado. Treinta pacientes con oclusión de vasos grandes se inscribirán en este estudio además de 15 controles sanos (n=45). Se extraerán muestras de sangre en 4 puntos de tiempo diferentes desde el inicio de los síntomas para cada paciente: (i) 0-6 horas, (ii) 6-12 horas, (iii) 12-24 horas y (iv) 5-7 días. También se evaluará la expresión diferencial de miARN entre los pacientes con diferentes grados colaterales

Dado que el proceso de maduración colateral probablemente comience poco después de los cambios hemodinámicos inducidos por LVO, los investigadores planean recolectar la primera muestra dentro de 0 a 6 horas. Se recolectarán tres muestras de sangre durante las primeras 24 horas para aumentar las posibilidades de capturar el perfil de expresión de miARN al comienzo del proceso de remodelación colateral. Los perfiles de miARN de estos pacientes se analizarán y compararán con voluntarios sanos. Además, se realizará una comparación entre pacientes con buen y mal grado colateral cerebral. Analizaremos los perfiles de miARN de estos pacientes utilizando los métodos que se describen a continuación.

Aislamiento y caracterización de exosomas: la cuantificación del número y tamaño de exosomas se llevará a cabo utilizando un NanoSight NS300 (Nanosight, Reino Unido) en el Núcleo de citometría analítica de OSU CCC como se describió anteriormente. Brevemente, los exosomas se aislarán del plasma libre de células utilizando el kit de aislamiento total de exosomas (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los exosomas se suspenderán en tampón PBS y se almacenarán a 4 °C durante un máximo de 7 días. A continuación, la suspensión de exosomas se diluirá para lograr una concentración de trabajo entre 2 x 108 y 8 x 108 para usar en el NanoSight NS300, después de lo cual se contarán y dimensionarán los exosomas11.

Aislamiento de ARN total: el ARN total se aislará de los exosomas suspendidos en PBS utilizando el kit de extracción de ácido nucleico circulante (Qiagen) como se describió anteriormente12. La contaminación del ADN se mitigará mediante el uso del conjunto de ADNasa libre de RNasa de Qiagen. El ARN se concentrará y purificará usando el kit de limpieza RNeasy MinElute (Qiagen) como se describe.

Ensayo NanoString: El sistema multiplexado de miARN nanoString nCounter (nanoString Technologies) en el CCC Genomics Shared Resource de la Universidad Estatal de Ohio se utilizará para el perfil de expresión de miARN como se describe12. El ARN total (100 ng) aislado de los exosomas se utilizará como material de entrada. Las muestras de ARN pequeñas se prepararán mediante la ligadura de una etiqueta de ADN específica en el extremo 3' de los miARN maduros según las instrucciones del fabricante (nanoString Technologies). Estas etiquetas normalizarán las temperaturas de fusión de los miARN y proporcionarán identificación para cada especie de miARN en la muestra. El exceso de etiquetas se lavará y el material resultante se hibridará con miARN: sondas indicadoras nCounter específicas de etiquetas. A continuación, las sondas hibridadas se purificarán e inmovilizarán en un cartucho recubierto de estreptavidina utilizando la estación de preparación nCounter (nanoString Technologies). El analizador digital nCounter se utilizará para contar códigos de barras fluorescentes individuales y cuantificar las moléculas de miARN presentes en cada muestra.

Normalización y análisis del perfil de expresión de miARN: el control de calidad, la normalización y los análisis de datos se realizarán mediante el software de análisis nSolver 2.0 (nanoString Technologies) como se describió anteriormente. La agrupación jerárquica de miARN identificados a través de la consulta nanoString se realizará mediante el software dChip (v 1.3). Los miARN expresados ​​diferencialmente en pacientes con puntuaciones colaterales buenas o malas (como se describe anteriormente) se definirán por un cambio de más o menos del doble usando el análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con un nivel de significación de p<0.05 y con corrección por tasa de descubrimiento falso.

Validación mediante RT-PCR de miARN exosómicos: los miARN seleccionados aislados de exosomas se transcribirán de forma inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc universal miRCURY LNA (Exiqon) de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se describió anteriormente. Los miARN se cuantificarán mediante PCR en tiempo real utilizando ExiLENT SYBR Green (Exiqon) en una plataforma Mx3000P qPCR, con expresión normalizada a una referencia de mantenimiento (es decir, SNORD44).