Identificação de microRNAs Envolvidos na Regulação de Colaterais Cerebrais (microRNA)

Os pacientes com idade > 18 anos que se apresentam ao Departamento de Emergência do Wexner Medical Center da Ohio State University (OSU) com AVC isquêmico agudo serão triados. Os investigadores incluirão pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico agudo de circulação anterior secundário à oclusão súbita aguda de grandes vasos (LVO). Indivíduos saudáveis ​​serão usados ​​como controles para avaliar miRNAs específicos para a população de AVC. Uma vez que a estenose preexistente hemodinamicamente significativa pode resultar em alteração da expressão do miRNA, os investigadores irão excluir pacientes com estenose > 50% da artéria carótida interna (ICA), > 50% estenose das artérias vertebrais bilaterais, bem como pacientes com doença aterosclerótica intracraniana moderada a grave como visto na angiografia por TC (CTA) da cabeça e pescoço. Para minimizar fatores de confusão, também serão excluídos pacientes com doença vascular periférica moderada a grave conhecida ou doença arterial coronariana sintomática com história de stent ou revascularização do miocárdio. Prisioneiros e mulheres grávidas também serão excluídos deste estudo. Será avaliada a expressão diferencial de microRNAs exossomais em pacientes com LVO agudo em comparação com controles saudáveis. Além disso, um neurorradiologista classificará a circulação colateral cerebral como (i) boa ou (ii) ruim, após revisar cuidadosamente os estudos de perfusão CTA e CT (CTP) em cada paciente usando o método de pontuação colateral validado. Trinta pacientes com oclusão de grandes vasos serão incluídos neste estudo, além de 15 controles saudáveis ​​(n=45). Amostras de sangue serão coletadas em 4 pontos de tempo diferentes desde o início dos sintomas para cada paciente: (i) 0-6 horas, (ii) 6-12 horas, (iii) 12-24 horas e (iv) 5-7 dias. A expressão diferencial de miRNA também será avaliada entre os pacientes com diferentes graus colaterais

Como o processo de maturação colateral provavelmente começa logo após as alterações hemodinâmicas induzidas pelo LVO, os investigadores planejam coletar a primeira amostra dentro de 0-6 horas. Três amostras de sangue serão coletadas nas primeiras 24 horas para aumentar as chances de capturar o perfil de expressão de miRNA no início do processo de remodelação colateral. Os perfis de miRNA desses pacientes serão então analisados ​​e comparados com voluntários saudáveis. Além disso, a comparação será feita entre pacientes com bom e mau grau de colateral cerebral. Analisaremos os perfis de miRNA desses pacientes usando os métodos descritos abaixo.

Isolamento e caracterização do exossomo: A quantificação do número e tamanho do exossomo será realizada usando um NanoSight NS300 (Nanosight, Reino Unido) no OSU CCC Analytical Cytometry Core, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os exossomos serão isolados do plasma livre de células usando o Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os exossomos serão suspensos em tampão PBS e armazenados a 4°C por até 7 dias. A suspensão de exossomos será então diluída para atingir uma concentração de trabalho entre 2 x 108 - 8 x 108 para uso no NanoSight NS300, após o que os exossomos serão contados e dimensionados11.

Isolamento de RNA total: O RNA total será isolado de exossomos suspensos em PBS usando o Kit de extração de ácido nucléico circulante (Qiagen) conforme descrito anteriormente12. A contaminação de DNA será mitigada através do uso do conjunto de DNase livre de RNase da Qiagen. O RNA será concentrado e purificado usando o RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) conforme descrito.

Ensaio de NanoString: O sistema de miRNA nanoString nCounter multiplexado (nanoString Technologies) no recurso compartilhado CCC Genomics da Universidade Estadual de Ohio será usado para criação de perfil de expressão de miRNA, conforme descrito12. O RNA total (100ng) isolado dos exossomos será utilizado como material de entrada. Amostras pequenas de RNA serão preparadas ligando uma tag específica de DNA na extremidade 3' de miRNAs maduros de acordo com as instruções do fabricante (nanoString Technologies). Essas tags irão normalizar as temperaturas de fusão dos miRNAs e fornecer identificação para cada espécie de miRNA na amostra. O excesso de tags será lavado e o material resultante hibridizado com sondas repórter nCounter específicas para miRNA:tag. As sondas hibridizadas serão então purificadas e imobilizadas em um cartucho revestido com estreptavidina usando o nCounter Prep Station (nanoString Technologies). O nCounter Digital Analyzer será usado para contar códigos de barras fluorescentes individuais e quantificar as moléculas de miRNA presentes em cada amostra.

Normalização e análises do perfil de expressão de miRNA: O controle de qualidade, a normalização e as análises de dados serão realizadas usando o software de análise nSolver 2.0 (nanoString Technologies), conforme descrito anteriormente. O agrupamento hierárquico dos miRNAs identificados por meio da consulta nanoString será realizado usando o software dChip (v 1.3). MiRNAs expressos diferencialmente em pacientes com pontuações colaterais boas ou ruins (conforme descrito acima) serão definidos por uma alteração maior ou menor que 2 vezes usando o ensaio de análise de variância (ANOVA) unidirecional com um nível de significância de p <0,05 e com correção para taxa de descoberta falsa.

Validação por RT-PCR de miRNAs exossomais: miRNAs selecionados isolados de exossomos serão transcritos reversamente usando o kit de síntese de cDNA universal miRCURY LNA (Exiqon) de acordo com o protocolo do fabricante conforme descrito anteriormente. Os miRNAs serão quantificados por PCR em tempo real usando ExiLENT SYBR Green (Exiqon) em uma plataforma Mx3000P qPCR, com expressão normalizada para uma referência de manutenção (ou seja, SNORD44).