Identifikation af mikroRNA'er involveret i cerebral collateral regulering (microRNA)

Patienter i alderen >18 år, der præsenterer for akutafdelingen ved Ohio State University (OSU) Wexner Medical Center med akut iskæmisk slagtilfælde, vil blive screenet. Efterforskerne vil inkludere patienter med akut iskæmisk slagtilfælde i forreste kredsløb sekundært til pludselig akut storkarokklusion (LVO). Raske forsøgspersoner vil blive brugt som kontroller til at vurdere miRNA'er, der er specifikke for slagtilfældepopulationen. Da hæmodynamisk signifikant allerede eksisterende stenose kan resultere i ændring af miRNA-ekspression, vil efterforskerne udelukke patienter med >50 % stenose af den indre halspulsåre (ICA), >50 % stenose af bilaterale vertebrale arterier samt patienter med moderat til svær intrakraniel aterosklerotisk sygdom som det ses i CT-angiogram (CTA) af hoved og hals. For at minimere konfounders vil patienter med kendt moderat til svær perifer vaskulær sygdom eller symptomatisk koronararteriesygdom med tidligere stent- eller koronararterie-bypassgraft også blive udelukket. Fanger og gravide kvinder vil også blive udelukket fra denne undersøgelse. Differentiel ekspression af exosomal mikroRNA hos patienter med akut LVO sammenlignet med raske kontroller vil blive evalueret. Derudover vil en neuroradiolog klassificere den cerebrale kollaterale cirkulation som (i) god eller (ii) dårlig, efter omhyggelig gennemgang af CTA- og CT-perfusionsundersøgelser (CTP) hos hver patient ved hjælp af valideret collateral scoring-metode. Tredive patienter med stor karokklusion vil blive inkluderet i denne undersøgelse ud over 15 raske kontroller (n=45). Blodprøver vil blive udtaget på 4 forskellige tidspunkter fra symptomdebut for hver patient: (i) 0-6 timer, (ii) 6-12 timer, (iii) 12-24 timer og (iv) 5-7 dage. Differentiel MiRNA-ekspression vil også blive evalueret mellem patienterne med forskellige kollaterale grader

Da processen med kollateral modning sandsynligvis begynder kort efter hæmodynamiske ændringer induceret af LVO, planlægger efterforskerne at indsamle den første prøve inden for 0-6 timer. Tre blodprøver vil blive indsamlet i løbet af de første 24 timer for at øge chancerne for at fange miRNA-ekspressionsprofilen i begyndelsen af ​​den kollaterale ombygningsproces. miRNA-profiler af disse patienter vil derefter blive analyseret og sammenlignet med raske frivillige. Derudover vil der blive foretaget sammenligning mellem patienter med god og dårlig cerebral collateral grad. Vi vil analysere miRNA-profilerne for disse patienter ved hjælp af metoder beskrevet nedenfor.

Eksosom isolering og karakterisering: Kvantificering af exosom antal og størrelse vil blive udført ved hjælp af en NanoSight NS300 (Nanosight, UK) ved OSU CCC Analytical Cytometri Core som tidligere beskrevet. Kort fortalt vil exosomer blive isoleret fra cellefrit plasma ved hjælp af Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) i henhold til producentens instruktioner. Exosomer vil blive suspenderet i PBS-buffer og opbevaret ved 4°C i op til 7 dage. Exosomsuspensionen vil derefter blive fortyndet for at opnå en arbejdskoncentration mellem 2 x 108 - 8 x 108 til brug i NanoSight NS300, hvorefter exosomer tælles og dimensioneres11.

Total RNA-isolering: Total RNA vil blive isoleret fra exosomer suspenderet i PBS ved hjælp af Circulating Nucleic Acid Extraction Kit (Qiagen) som tidligere beskrevet12. DNA-kontaminering vil blive afbødet ved brug af Qiagens RNase-fri DNase-sæt. RNA vil blive koncentreret og oprenset ved hjælp af RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) som beskrevet.

NanoString Assay: Det multipleksede nanoString nCounter miRNA-system (nanoString Technologies) ved Ohio State University CCC Genomics Shared Resource vil blive brugt til miRNA-ekspressionsprofilering som beskrevet12. Total RNA (100ng) isoleret fra exosomer vil blive brugt som inputmateriale. Små RNA-prøver vil blive fremstillet ved at ligere et specifikt DNA-tag på 3'-enden af ​​modne miRNA'er i henhold til producentens instruktioner (nanoString Technologies). Disse tags vil normalisere smeltetemperaturerne for miRNA'erne og give identifikation for hver miRNA-art i prøven. Overskydende tags vil blive vasket væk, og det resulterende materiale hybridiseres med miRNA: tag-specifikke nCounter-reporterprober. Hybridiserede prober vil derefter blive oprenset og immobiliseret på en streptavidin-belagt patron ved hjælp af nCounter Prep Station (nanoString Technologies). nCounter Digital Analyzer vil blive brugt til at tælle individuelle fluorescerende stregkoder og kvantificere miRNA-molekyler til stede i hver prøve.

miRNA Expression Profile Normalization and Analyser: Kvalitetskontrol, normalisering og dataanalyser vil blive udført ved hjælp af nSolver 2.0 Analysis Software (nanoString Technologies) som tidligere beskrevet. Hierarkisk clustering af miRNA'er identificeret gennem nanoString-forespørgslen vil blive udført ved hjælp af dChip (v 1.3) software. Differentielt udtrykte miRNA'er hos patienter med gode eller dårlige kollaterale scores (som beskrevet ovenfor) vil blive defineret ved en større end eller mindre end 2-fold ændring ved anvendelse af envejs variansanalyse (ANOVA) assay med et signifikansniveau på p<0,05 og med korrektion for falsk opdagelsesrate.

RT-PCR-validering af exosomale miRNA'er: Udvalgte miRNA'er isoleret fra exosomer vil blive omvendt transskriberet ved hjælp af miRCURY LNA Universal cDNA-syntesesættet (Exiqon) i henhold til producentens protokol som beskrevet tidligere. miRNA'er vil blive kvantificeret ved realtids-PCR ved hjælp af ExiLENT SYBR Green (Exiqon) på en Mx3000P qPCR-platform med ekspression normaliseret til en husholdningsreference (dvs. SNORD44).