대뇌 부수적 조절에 관여하는 마이크로RNA의 동정 (microRNA)

급성 허혈성 뇌졸중으로 오하이오 주립 대학(OSU) 웩스너 메디컬 센터의 응급실에 내원하는 18세 이상의 환자를 선별할 것입니다. 연구자들은 갑작스러운 급성 대혈관 폐색(LVO)에 이차적인 전방 순환 급성 허혈성 뇌졸중 환자를 포함할 것입니다. 건강한 피험자는 뇌졸중 집단에 특정한 miRNA를 평가하기 위한 대조군으로 사용됩니다. 혈역학적으로 유의미한 기존 협착증이 miRNA 발현의 변화를 초래할 수 있기 때문에 연구자들은 내경동맥(ICA)의 >50% 협착증, >50% 양측 척추 동맥의 협착증이 있는 환자와 중등도에서 중증의 두개내 죽상경화증 환자를 제외할 것입니다. 머리와 목의 CT Angiogram(CTA)에서 볼 수 있듯이. 혼동 요인을 최소화하기 위해 알려진 중등도에서 중증의 말초 혈관 질환 또는 스텐트 또는 관상 동맥 우회 이식의 병력이 있는 증상이 있는 관상 동맥 질환이 있는 환자도 제외됩니다. 수감자와 임산부도 이 연구에서 제외됩니다. 건강한 대조군과 비교하여 급성 LVO 환자에서 엑소좀 마이크로RNA의 다른 발현이 평가될 것입니다. 또한 신경방사선 전문의는 검증된 측부 점수 매기기 방법을 사용하여 각 환자의 CTA 및 CT 관류(CTP) 연구를 주의 깊게 검토한 후 대뇌 측부 순환을 (i) 양호 또는 (ii) 불량으로 등급을 매길 것입니다. 15명의 건강한 대조군(n=45) 외에 30명의 큰 혈관 폐색 환자가 이 연구에 등록될 것입니다. 혈액 샘플은 각 환자에 대해 증상 개시로부터 4개의 다른 시점에서 채취됩니다: (i) 0-6시간, (ii) 6-12시간, (iii) 12-24시간 및 (iv) 5-7일. 차등 MiRNA 발현은 또한 다양한 담보 등급을 가진 환자들 사이에서 평가될 것입니다.

측부 성숙 과정은 LVO에 의해 유도된 혈역학적 변화 직후에 시작될 가능성이 높기 때문에 연구자들은 0-6시간 이내에 첫 번째 샘플을 수집할 계획입니다. 3개의 혈액 샘플을 처음 24시간 동안 수집하여 부수적 리모델링 프로세스 시작 시 miRNA 발현 프로필을 캡처할 가능성을 높입니다. 그런 다음 이러한 환자의 miRNA 프로필을 분석하고 건강한 지원자와 비교합니다. 또한, 대뇌 측부 등급이 좋은 환자와 나쁜 환자를 비교합니다. 아래에 설명된 방법을 사용하여 이러한 환자의 miRNA 프로필을 분석합니다.

엑소좀 분리 및 특성화: 엑소좀 수 및 크기의 정량화는 이전에 설명한 바와 같이 OSU CCC 분석 세포측정 코어에서 NanoSight NS300(Nanosight, UK)을 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해서, 엑소좀은 제조업체의 지침에 따라 Total Exosome Isolation Kit(Invitrogen)를 사용하여 무세포 혈장에서 분리됩니다. 엑소좀은 PBS 버퍼에 현탁되고 최대 7일 동안 4°C에서 보관됩니다. 그런 다음 엑소좀 현탁액을 희석하여 NanoSight NS300에서 사용하기 위해 2 x 108 - 8 x 108 사이의 작업 농도를 달성한 후 엑소좀을 계산하고 크기를 지정합니다11.

총 RNA 분리: 총 RNA는 이전에 설명한 대로 Circulating Nucleic Acid Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 PBS에 현탁된 엑소좀에서 분리됩니다12. DNA 오염은 Qiagen의 RNase-free DNase 세트를 사용하여 완화됩니다. 설명된 대로 RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)를 사용하여 RNA를 농축 및 정제합니다.

NanoString Assay: 오하이오 주립 대학 CCC Genomics Shared Resource의 다중화된 nanoString nCounter miRNA 시스템(nanoString Technologies)은 설명된 대로 miRNA 발현 프로파일링에 사용됩니다12. 엑소좀에서 분리한 total RNA(100ng)를 투입물질로 사용합니다. 작은 RNA 샘플은 제조업체의 지침(nanoString Technologies)에 따라 성숙한 miRNA의 3' 말단에 특정 DNA 태그를 연결하여 준비됩니다. 이 태그는 miRNA의 녹는 온도를 정상화하고 샘플의 각 miRNA 종에 대한 식별을 제공합니다. 잉여 태그는 씻겨 나가고 생성된 물질은 miRNA:태그 특정 nCounter 리포터 프로브와 혼성화됩니다. 혼성화 프로브는 nCounter Prep Station(nanoString Technologies)을 사용하여 스트렙타비딘 코팅 카트리지에 정제되고 고정됩니다. nCounter 디지털 분석기는 개별 형광 바코드를 계산하고 각 샘플에 존재하는 miRNA 분자를 정량화하는 데 사용됩니다.

miRNA 발현 프로필 정규화 및 분석: 앞에서 설명한 대로 nSolver 2.0 분석 소프트웨어(nanoString Technologies)를 사용하여 품질 관리, 정규화 및 데이터 분석을 수행합니다. nanoString 쿼리를 통해 식별된 miRNA의 계층적 클러스터링은 dChip(v 1.3) 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 양호하거나 불량한 측부 점수(위에서 설명한 바와 같음)를 가진 환자에서 차등적으로 발현된 miRNA는 유의 수준 p<0.05 및 잘못된 발견 비율을 수정합니다.

엑소좀 miRNA의 RT-PCR 검증: 엑소좀에서 분리된 선택 miRNA는 이전에 설명한 대로 제조업체의 프로토콜에 따라 miRCURY LNA Universal cDNA 합성 키트(Exiqon)를 사용하여 역전사됩니다. miRNA는 하우스키핑 참조(예: 스노드44).