Identifizierung von microRNAs, die an der Regulation zerebraler Sicherheiten beteiligt sind (microRNA)

Patienten im Alter von > 18 Jahren, die sich mit einem akuten ischämischen Schlaganfall in der Notaufnahme des Wexner Medical Center der Ohio State University (OSU) vorstellen, werden untersucht. Die Ermittler werden Patienten mit akutem ischämischem Schlaganfall im vorderen Kreislauf als Folge eines plötzlichen akuten Verschlusses großer Gefäße (LVO) umfassen. Gesunde Probanden werden als Kontrollen verwendet, um miRNAs zu bewerten, die für die Schlaganfallpopulation spezifisch sind. Da eine hämodynamisch signifikante vorbestehende Stenose zu einer Veränderung der miRNA-Expression führen kann, werden die Prüfärzte Patienten mit > 50 % Stenose der A. carotis interna (ICA), > 50 % Stenose der bilateralen Wirbelarterien sowie Patienten mit mittelschwerer bis schwerer intrakranieller atherosklerotischer Erkrankung ausschließen wie im CT-Angiogramm (CTA) von Kopf und Hals zu sehen. Um Störfaktoren zu minimieren, werden auch Patienten mit bekannter mittelschwerer bis schwerer peripherer Gefäßerkrankung oder symptomatischer Koronararterienerkrankung mit Stent- oder Koronararterien-Bypass-Transplantation in der Vorgeschichte ausgeschlossen. Gefangene und schwangere Frauen werden ebenfalls von dieser Studie ausgeschlossen. Die unterschiedliche Expression von exosomalen microRNAs bei Patienten mit akutem LVO im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen wird bewertet. Darüber hinaus wird ein Neuroradiologe die zerebrale Kollateralzirkulation als (i) gut oder (ii) schlecht einstufen, nachdem er die CTA- und CT-Perfusionsstudien (CTP) bei jedem Patienten unter Verwendung einer validierten Kollateralbewertungsmethode sorgfältig überprüft hat. Dreißig Patienten mit Verschluss großer Gefäße werden zusätzlich zu 15 gesunden Kontrollpersonen (n=45) in diese Studie aufgenommen. Blutproben werden bei jedem Patienten zu 4 verschiedenen Zeitpunkten ab Symptombeginn entnommen: (i) 0–6 Stunden, (ii) 6–12 Stunden, (iii) 12–24 Stunden und (iv) 5–7 Tage. Die unterschiedliche MiRNA-Expression wird auch zwischen den Patienten mit unterschiedlichen Kollateralgraden bewertet

Da der Prozess der Kollateralreifung wahrscheinlich kurz nach den durch LVO induzierten hämodynamischen Veränderungen beginnt, planen die Forscher, die erste Probe innerhalb von 0–6 Stunden zu entnehmen. Während der ersten 24 Stunden werden drei Blutproben entnommen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, das miRNA-Expressionsprofil zu Beginn des Kollateralumbauprozesses zu erfassen. Die miRNA-Profile dieser Patienten werden dann analysiert und mit gesunden Probanden verglichen. Darüber hinaus wird ein Vergleich zwischen Patienten mit gutem und schlechtem zerebralem Kollateralgrad durchgeführt. Wir werden die miRNA-Profile dieser Patienten mit den unten beschriebenen Methoden analysieren.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen: Die Quantifizierung der Anzahl und Größe von Exosomen wird mit einem NanoSight NS300 (Nanosight, UK) am OSU CCC Analytical Cytometry Core wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt werden Exosomen aus zellfreiem Plasma unter Verwendung des Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Exosomen werden in PBS-Puffer suspendiert und bis zu 7 Tage bei 4 °C gelagert. Die Exosomensuspension wird dann verdünnt, um eine Arbeitskonzentration zwischen 2 x 108 und 8 x 108 für die Verwendung im NanoSight NS300 zu erreichen, wonach die Exosomen gezählt und deren Größe bestimmt werden11.

Gesamt-RNA-Isolierung: Die Gesamt-RNA wird aus in PBS suspendierten Exosomen unter Verwendung des Circulating Nucleic Acid Extraction Kit (Qiagen) wie zuvor beschrieben12 isoliert. Die DNA-Kontamination wird durch die Verwendung des RNase-freien DNase-Sets von Qiagen verringert. Die RNA wird wie beschrieben mit dem RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) konzentriert und gereinigt.

NanoString-Assay: Das multiplexierte miRNA-System nanoString nCounter (nanoString Technologies) an der Ohio State University CCC Genomics Shared Resource wird wie beschrieben für die Profilerstellung der miRNA-Expression verwendet12. Als Ausgangsmaterial wird aus Exosomen isolierte Gesamt-RNA (100 ng) verwendet. Kleine RNA-Proben werden durch Ligation eines spezifischen DNA-Tags an das 3'-Ende reifer miRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers (nanoString Technologies) hergestellt. Diese Tags normalisieren die Schmelztemperaturen der miRNAs und bieten eine Identifizierung für jede miRNA-Spezies in der Probe. Überschüssige Tags werden weggewaschen und das resultierende Material mit miRNA:tag-spezifischen nCounter-Reportersonden hybridisiert. Hybridisierte Sonden werden dann gereinigt und auf einer Streptavidin-beschichteten Kartusche mit der nCounter Prep Station (nanoString Technologies) immobilisiert. Der nCounter Digital Analyzer wird verwendet, um einzelne fluoreszierende Barcodes zu zählen und die in jeder Probe vorhandenen miRNA-Moleküle zu quantifizieren.

Normalisierung und Analysen des miRNA-Expressionsprofils: Qualitätskontrolle, Normalisierung und Datenanalysen werden mit der nSolver 2.0-Analysesoftware (nanoString Technologies) wie zuvor beschrieben durchgeführt. Das hierarchische Clustering von miRNAs, die durch die nanoString-Abfrage identifiziert wurden, wird unter Verwendung der dChip-Software (v 1.3) durchgeführt. Differentiell exprimierte miRNAs bei Patienten mit guten oder schlechten Kollateralwerten (wie oben beschrieben) werden durch eine mehr als oder weniger als 2-fache Veränderung unter Verwendung eines Einweg-Varianzanalyse-Assays (ANOVA) mit einem Signifikanzniveau von p < 0,05 und definiert mit Korrektur für falsche Entdeckungsrate.

RT-PCR-Validierung von exosomalen miRNAs: Ausgewählte aus Exosomen isolierte miRNAs werden mit dem miRCURY LNA Universal cDNA-Synthesekit (Exiqon) gemäß dem Protokoll des Herstellers, wie zuvor beschrieben, revers transkribiert. miRNAs werden durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von ExiLENT SYBR Green (Exiqon) auf einer Mx3000P qPCR-Plattform quantifiziert, wobei die Expression auf eine Haushaltsreferenz (d. h. SNORD44).