COVID 19 の転帰予測におけるバイオマーカーの役割の調査

目的

1. バンクーバー総合病院の患者における COVID-19 過炎症性「サイトカイン ストーム」表現型の有病率を特定する
2. COVID-19 患者におけるサイトカインストームと ARDS との潜在的な関連を特定する
3. 自力で回復する患者から緊急の治療を必要とする患者をトリアージするための迅速なテストに開発できるバイオマーカーを特定するために、軽度および重度の疾患を有する患者のプロファイリングを行う
4. COVID-19 の臨床転帰に対する遺伝的変異の影響を解明する
5. SARS-CoV-2 関連 RNA の特定
6. COVID-19 患者の臨床ケアの一環として、患者が免疫調節療法で治療される前後の生理学的およびサイトカインレベルの違いを判断すること。

仮説

1. プライマリ: 以前のレポートに基づくと、COVID-19 患者の約 50% がサイトカインストームの表現型を示します。
2. 二次的: a) サイトカインストームを示す患者は、ARDS の発生率が高いことを示す b) 迅速な検査のためのバイオマーカーを特定する c) 宿主遺伝子の変異は、COVID-19 感染による臨床転帰に影響を与える

正当化

2019年の新しいヒトコロナウイルスは、もともと2019-nCoVと名付けられ、現在は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）と呼ばれており、2019年12月下旬に中国の湖北省の武漢で発生しました。 このウイルスは、現在 COVID-19 として知られている病気を引き起こします。 その発見に続いて、SARS-CoV-2 はその後、そのゲノム配列が解読され、細胞侵入受容体が決定されました。 その急速な世界的広がりと地域感染の証拠は、私たちの医療制度と経済への長期にわたる影響の可能性を示しています。 これには、COVID-19 の治療戦略と治療管理を見極めるために、医療従事者と科学者による協調的な対応が必要です。

ワクチンや抗ウイルス薬の開発努力以外では、新しい治療介入への注目は比較的最小限に抑えられており、これまでに臨床試験の報告はほとんどなく、他の治療戦略に加えて宿主指向療法を探索するための行動喚起を引き出しています。 最近発表されたこの疾患の臨床的説明は、多くの患者が「サイ​​トカインストーム」と呼ばれる過剰炎症状態と、しばしば急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) の発症に起因するその後の死亡の両方に苦しんでいることを示しています。 ただし、サイトカインストームは疾患の重症度に関連しているように見えますが、サイトカインストームの存在と、現在 COVID-19 による死亡の最大の割合を占めている ARDS の発症との間の重要な関連性はまだ確立されていません。 そのようなリンクの描写と過炎症の臨床的確立（すなわち サイトカイン ストーム) 表現型は、COVID-19 関連の ARDS の発生率と死亡率を減らすための特定の抗炎症治療の優先順位を提供しますが、これは現在議論されているためです。

CyTOF 分析: 可能な限り幅広い血統細胞配列に開発された 31 のモノクローナル抗体のカスタム パネルを使用して適用される単一細胞プロテオミクス ツールです。 McNagny は、この技術を AllerGEN NCE (この NCE の Associate Scientific Director) のプラットフォームとして開発しました。 これまでにない詳細さで、成熟した血液および前駆細胞のまれなサブセットを識別します。 これには、プライミング免疫応答および骨髄血球前駆細胞において強力な役割を果たす自然リンパ球 (ILC) のマーカーが含まれます。 慢性炎症と重度の急性炎症はどちらも、炎症細胞産生の急速な増加と骨髄前駆細胞の早期放出につながります。 このパネルは内部で検証されており、呼吸器感染症の影響をより深刻に受けていると思われる集団である慢性アレルギー疾患の成人患者を特定する際の有用性が示されています。 自力で回復する患者から緊急の治療を必要とする患者をトリアージするための迅速なテストに開発できるバイオマーカーを特定する試みで、軽度および重度の疾患の患者をプロファイリングするという目標があります。

遺伝子検査: 著者は、宿主の遺伝子の違いが敗血症の臨床転帰に重大な影響を与えることを示しています。 たとえば、CETP 遺伝子の 1 つのヌクレオチド変異体は、敗血症による 28 日以内の死亡率のリスクを 2 倍以上にすることを示しました。 仮説は、他の重篤な疾患と同様に、宿主の遺伝子変異も COVID-19 感染の臨床転帰に影響を与えるというものです。 この研究は、COVID-19 の臨床転帰に対する遺伝的変異の影響を解明することを目的としています。

RNA テスト: 循環する無細胞 RNA 種は通常、細胞外小胞 (EV) にカプセル化されており、体液中での分解から保護されています。 さまざまな循環 RNA バイオタイプが存在し、マイクロ RNA (miRNA) が最も研究されているクラスです。 これらおよびその他の循環 RNA は、細胞間コミュニケーションに関与することができ、対照と比較して患者で異なって発現することができ、敗血症を含むさまざまな急性および救命医療の適応症における疾患の進行、普及、または薬物反応に関連付けることができます。神経外傷、および心血管疾患。

最小限の入力量のヒト血漿または血清から信頼性の高い完全な循環 RNA データを取得できるように、条件が最適化されています。 200 ul の血清を使用した最初の研究では、約 15 ng の RNA が得られました。これは、次世代シーケンシング用のライブラリーを生成するための最小インプットである 100 pg を明らかに超えています。 3 人の健康なボランティア ドナーからのパイロット分析では、サンプルあたり 1,000 万読み取りを超える品質基準に合格し、平均 359 の miRNA の合計シグネチャでエキソソーム miRNA の 98% が検出されたことが確認されました。 重要なことに、この方法では、臨床研究に非常に適したサンプル量から、潜在的に有益な循環 RNA の転写ランドスケープ全体に関するデータも得られます。 単一のヒトドナーからの血清と血漿の両方を使用したさらなる最適化研究により、わずか50μlの入力量から良質のRNAデータが得られ、血清と血漿の両方で予想されるRNAバイオタイプ分布が見られることが示されました

目的

1) COVID-19 患者におけるサイトカインストームと ARDS の関連性 2) 軽症および重症の COVID-19 患者のバイオマーカープロファイル 3) COVID-19 患者の臨床転帰に対する遺伝的変異の影響

リサーチデザイン

概要

COVID-19が疑われるバンクーバー総合病院（VGH）またはサリー記念病院（SMH）の集中治療室（ICU）および高視力治療室（HAU）に入院した患者は、隔離ユニットで隔離されます。 ここでは、SARS-CoV-2 の検査室での確認のために検体が収集されます。 COVID-19の管理に関するVGH / VCHの現在の運用手順に従って、臨床ケアが開始され、主治医の裁量によって導かれます。

臨床ケアが開始されると、血液サンプルは、ICU/HAU の臨床スタッフによって ICU/HAU 入院後 1～7、10、14、および 21 日目にバキュテナー血清分離チューブ (SST、Vacutainer®、Becton &ディキンソン）。 これらのサンプルは、サイトカイン、炎症マーカー、CyTOF、RNA、および遺伝子検査のパネルについて分析されます。 分析は、1) David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC) の Dr. Cheryl Wellington の研究室、2) Dr. Kelly McNagny の研究室、DMCBH、UBC.、3) Dr. セント・ポール病院のセンター・フォー・ハート・ラング・イノベーション（HLI）にあるリアム・ブルナムの研究室。

サイトカインストーム症候群の日常診療の一環として投与される免疫調節療法の投与前後における無人工呼吸日数、PaO2/FiO2、炎症性サイトカインの変化をネステッドマッチドコホート研究で検討する。

統計分析

この病気の流行が最近発生したため、堅牢な統計的検出力テストが困難になっています。 ただし、黄と同僚の最近の研究からのデータをデジタル化することにより、重症のCOVID患者のサイトカインストームを実証するいくつかのレポートの1つであり、IL-1b、IL-2、IL-10、およびTNF-αに基づくサンプル計算データが提供されます。 以下に示す検出力の計算は、独立したサンプルのノンパラメトリック Mann-Whitney-U 検定に対するものであり、G*power (V3.1.9.1) で実行されました。

IL-1: これは、Huang と同僚による報告では有意差はありませんでした (Huang et al., 2020)。

IL-2: Huang と共同研究者から得られた推定平均±SD は、重症の COVID-19 患者と非重症の COVID-19 患者の IL-2 の 9.5±4.3 pg/mL および 6.7±4.3 pg/mL で、グループあたり約 40 人の患者 (80合計) 差を検出するために必要です (検出力 = 0.80、アルファ = 0.05)

IL-6: これは Huang と同僚によって測定されませんでしたが (Huang et al., 2020)、合計 150 人の患者のサンプルサイズで、Ruan と同僚は IL-6 レベルの有意差を検出することができました (Ruan et al. 、2020年）。

IL-10: 19.5±39.6 および 5.3±4.3 の Huang および同僚に由来する推定平均±SD を使用 重症の COVID-19 患者と重症ではない COVID-19 患者の IL-10 の pg/mL を比較すると、差を検出するには、グループあたり最大 60 人の患者 (合計 120 人) が必要になります (検出力 = 0.80、アルファ = 0.05)。

TNF-α: 93.2±20.8 および 71.7±21.4 の Huang および同僚から得られた推定平均±SD を使用 重症の COVID-19 患者と重症ではない COVID-19 患者の TNF-α の pg/mL、差を検出するには、グループごとに最大 17 人の患者 (合計 34 人) が必要です (検出力 = 0.80、アルファ = 0.05)

上記のサンプルサイズの見積もり、IL-6の顕著な違いがルアンと同僚によっても報告されたこと、および今後数か月にわたるCOVID-19患者の予想される入院率を考えると、最大150人の患者を募集することを目指しています.

log2倍の変化> 1および調整されたp値<0.05は、差別的に調節されたRNAの有意性のしきい値として使用されます。 Ingenuity Pathway Analysis を使用して因果ネットワークを特定し、さらに分析を負の log p 値 > 20 のしきい値に設定します。 抗菌反応、炎症反応、感染症フィルターを使用して、SARS-CoV-2 関連 RNA を特定します。 ヒート マップは、比較分析によって生成されます。

分析計画

プライマリ: ARDS を発症する患者と発症しない患者のサイトカインのレベルを比較します。 独立したサンプルの t 検定を使用して、データが正規分布している場合 (Shapiro Wilks 検定で決定)、またはデータが正規分布していない場合は Mann-Whitney-U 検定を使用します。

アプリオリ分析: 臨床治療の一環として投与された免疫抑制剤または抗ウイルス薬の効果と、生理学的転帰および血清バイオマーカーの変化を評価します。

二次: 二次的な目的を達成するための探索的分析では、毎日のサイトカイン測定を利用して、COVID-19 患者の ARDS の発症に関連するサイトカインの閾値があるかどうかを判断します。

ネストされた一致コホート研究:

1. 独立したサンプルの両側 t 検定を使用して、トシリズマブ (臨床ケアの一環として投与) と支援グループの人工呼吸器の使用がない日の違いを調べます。
2. 独立サンプルの両側 t 検定を使用して、トシリズマブ (臨床ケアの一環として投与) および支持群における心肺生理学的転帰 (PaO2/FiO2、平均動脈圧および心拍数) の違いを調べます。
3. 独立したサンプルの両側 t 検定を使用して、トシリズマブ (臨床ケアの一環として投与) と支持グループの血清炎症性サイトカインの違いを調べます。