Untersuchung der Rolle von Biomarkern bei der Vorhersage des Ergebnisses von COVID 19

ZWECKE

1. Bestimmen Sie die Prävalenz eines hyperinflammatorischen COVID-19-„Zytokinsturm“-Phänotyps bei Patienten im Vancouver General Hospital
2. Bestimmen Sie mögliche Verbindungen zwischen Zytokinsturm und ARDS bei COVID-19-Patienten
3. Profilieren Sie Patienten mit leichten und schweren Erkrankungen, um Biomarker zu identifizieren, die zu einem Schnelltest für die Triage von Patienten entwickelt werden könnten, die dringend Pflege benötigen, von denen, die sich von selbst erholen
4. Klären Sie die Auswirkungen der genetischen Variation auf die klinischen Ergebnisse von COVID-19 auf
5. Identifizieren Sie SARS-CoV-2-relevante RNAs
6. Um Unterschiede in den physiologischen und Zytokinspiegeln vor und nach der Behandlung von Patienten mit immunmodulatorischen Therapien im Rahmen der klinischen Versorgung von COVID-19-Patienten zu bestimmen.

HYPOTHESEN

1. Primär: Basierend auf früheren Berichten weisen etwa 50 % der COVID-19-Patienten einen Zytokinsturm-Phänotyp auf
2. Sekundär: a) Patienten mit Zytokinsturm zeigen eine höhere Inzidenz von ARDS b) Wir werden Biomarker für Schnelltests identifizieren c) Die Variation des Wirtsgens wird das klinische Ergebnis einer COVID-19-Infektion beeinflussen

RECHTFERTIGUNG

Das neuartige menschliche Coronavirus 2019, ursprünglich 2019-nCoV genannt und jetzt als Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom bezeichnet, entstand Ende Dezember 2019 in Wuhan in der Provinz Hubei in China. Dieses Virus verursacht die Krankheit, die jetzt als COVID-19 bekannt ist. Nach seiner Entdeckung wurde das Genom von SARS-CoV-2 sequenziert und der Zelleintrittsrezeptor bestimmt. Seine rasche weltweite Verbreitung und Hinweise auf eine Übertragung durch die Gemeinschaft deuten auf einen wahrscheinlich langwierigen Einfluss auf unser Gesundheitssystem und unsere Wirtschaft hin. Dies erfordert eine koordinierte Reaktion von Mitarbeitern des Gesundheitswesens und Wissenschaftlern, um Strategien für die Behandlung und das therapeutische Management von COVID-19 zu erkennen.

Abgesehen von den Bemühungen um die Entwicklung von Impfstoffen und antiviralen Mitteln war der Fokus auf neuartige therapeutische Interventionen vergleichsweise gering, mit bisher wenigen Berichten über klinische Studien, was zu einem Handlungsaufruf geführt hat, neben anderen therapeutischen Strategien auch wirtsgerichtete Therapien zu erforschen. Kürzlich veröffentlichte klinische Beschreibungen dieser Krankheit haben gezeigt, dass viele Patienten sowohl an einem hyperinflammatorischen Zustand leiden, der als "Zytokinsturm" bezeichnet wird, als auch an einem anschließenden Tod, der oft der Entwicklung eines akuten Atemnotsyndroms (ARDS) zuzuschreiben ist. Obwohl der Zytokinsturm mit der Schwere der Krankheit in Verbindung gebracht zu werden scheint, müssen die wichtigsten Zusammenhänge zwischen dem Vorhandensein des Zytokinsturms und der Entwicklung von ARDS, das derzeit für den größten Teil der COVID-19-Todesfälle verantwortlich ist, noch festgestellt werden. Abgrenzung eines solchen Zusammenhangs und klinische Etablierung einer hyperinflammatorischen (d. h. Zytokinsturm)-Phänotyp würde spezifischen entzündungshemmenden Behandlungen Vorrang geben, um die Inzidenz von COVID-19-assoziiertem ARDS und die Mortalität zu reduzieren, da dies derzeit noch diskutiert wird.

CyTOF-Analysen: ist ein Einzelzell-Proteomik-Tool, das unter Verwendung eines benutzerdefinierten Panels von 31 monoklonalen Antikörpern angewendet wird, die wir für die größtmögliche Auswahl an Zellen der Blutlinie entwickelt haben. McNagny hat diese Technologie als Plattform für das AllerGEN NCE (Associate Scientific Director of this NCE) entwickelt. Es identifiziert mit beispielloser Genauigkeit seltene Untergruppen von reifen Blut- und Vorläuferzellen. Es umfasst Marker angeborener lymphatischer Zellen (ILCs), die eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Immunantworten spielen, sowie Vorläuferzellen von Blutzellen im Knochenmark. Chronische Entzündungen und schwere akute Entzündungen führen beide zu einem raschen Anstieg der Produktion von Entzündungszellen und einer vorzeitigen Freisetzung von Knochenmarksvorläuferzellen. Das Panel wurde intern validiert und hat sich als nützlich bei der Identifizierung erwachsener Patienten mit chronischen allergischen Erkrankungen erwiesen, einer Patientengruppe, die offenbar stärker von Atemwegsinfektionen betroffen ist. Es wird ein Ziel sein, Patienten mit leichter und schwerer Krankheit zu profilieren, um Biomarker zu identifizieren, die zu einem Schnelltest für die Triage von Patienten entwickelt werden könnten, die dringend Pflege benötigen, von denen, die sich von selbst erholen.

Gentests: Die Autoren haben gezeigt, dass genetische Unterschiede des Wirts einen signifikanten Einfluss auf die klinischen Ergebnisse einer Sepsis haben. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass eine einzige Nukleotidvariante im CETP-Gen das Risiko einer 28-Tage-Mortalität durch Sepsis mehr als verdoppelt. Die Hypothese ist, dass, ähnlich wie bei anderen Formen kritischer Erkrankungen, auch die Wirtsgenvariation das klinische Ergebnis einer COVID-19-Infektion beeinflusst. Diese Arbeit soll die Auswirkungen der genetischen Variation auf die klinischen Ergebnisse von COVID-19 aufklären.

RNA-Tests: Zirkulierende zellfreie RNA-Spezies sind typischerweise in extrazellulären Vesikeln (EVs) eingekapselt, die sie vor dem Abbau in Körperflüssigkeiten schützen. Es gibt eine Vielzahl zirkulierender RNA-Biotypen, wobei Mikro-RNAs (miRNAs) die am besten untersuchte Klasse sind. Diese und andere zirkulierende RNAs können an der Zell-zu-Zell-Kommunikation teilnehmen, können bei Patienten unterschiedlich exprimiert werden im Vergleich zu Kontrollen und können mit dem Fortschreiten der Krankheit, der Verbreitung oder dem Ansprechen auf Arzneimittel bei einer Vielzahl von akuten und kritischen Indikationen, einschließlich Sepsis, assoziiert sein. Neurotrauma und Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Die Bedingungen sind optimiert, um zuverlässige und vollständige Daten zur zirkulierenden RNA aus minimalen Eingangsvolumina von menschlichem Plasma oder Serum zu erhalten. Anfängliche Studien mit 200 ul Serum ergaben ~15 ng RNA, was die minimale Zugabe von 100 pg zur Generierung von Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation deutlich überstieg. Die Pilotanalyse von 3 gesunden menschlichen freiwilligen Spendern erfüllte die Qualitätskriterien von über 10 Mio. Reads/Probe und bestätigte, dass 98 % der exosomalen miRNAs in Gesamtsignaturen von durchschnittlich 359 miRNAs nachgewiesen wurden. Wichtig ist, dass diese Methode auch Daten über die gesamte Transkriptionslandschaft potenziell informativer zirkulierender RNAs aus Probenvolumina liefert, die für klinische Studien sehr gut geeignet sind. Weitere Optimierungsstudien unter Verwendung von sowohl Serum als auch Plasma von einem einzelnen menschlichen Spender zeigten, dass RNA-Daten von guter Qualität aus einem Eingangsvolumen von nur 50 µl erhalten werden konnten und dass die erwarteten RNA-Biotypverteilungen sowohl für Serum als auch für Plasma gefunden wurden

ZIELE

Besseres Verständnis 1) der Zusammenhänge zwischen Zytokinsturm und ARDS bei COVID-19-Patienten, 2) des Biomarkerprofils von COVID-19-Patienten mit leichter und schwerer Erkrankung, 3) der Auswirkungen der genetischen Variation auf die klinischen Ergebnisse bei COVID-19-Patienten

FORSCHUNGSDESIGN

Überblick

Patienten, die mit Verdacht auf COVID-19 auf die Intensivstation (ICU) und die High Acuity Unit (HAU) des Vancouver General Hospital (VGH) oder des Surrey Memorial Hospital (SMH) eingeliefert werden, werden in einer Isolierstation unter Quarantäne gestellt. Hier werden Proben zur Laborbestätigung von SARS-CoV-2 gesammelt. Die klinische Versorgung beginnt und richtet sich nach dem Ermessen der behandelnden Ärzte gemäß dem aktuellen Betriebsverfahren von VGH/VCH für das Management von COVID-19.

Sobald die klinische Versorgung begonnen hat, wird an den Tagen 1–7, 10, 14 und 21 nach der Aufnahme auf der Intensivstation/HAU eine Blutprobe vom klinischen Personal auf der Intensivstation/HAU in Vacutainer-Serumtrennröhrchen (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Diese Proben werden auf eine Reihe von Zytokinen, Entzündungsmarkern, CyTOF, RNA und Gentests analysiert. Die Analysen werden 1) im Labor von Dr. Cheryl Wellington am David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) im Labor von Dr. Kelly McNagny, DMCBH, UBC, 3) Dr. Liam Brunhams Labor am Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

Es wird eine verschachtelte abgestimmte Kohortenstudie durchgeführt, um die Veränderungen der beatmungsfreien Tage, des PaO2/FiO2 und der entzündlichen Zytokine vor und nach der Verabreichung von immunmodulatorischen Therapien zu untersuchen, die im Rahmen der routinemäßigen klinischen Behandlung des Zytokinsturmsyndroms verabreicht werden.

STATISTISCHE ANALYSE

Die Aktualität dieses Krankheitsausbruchs erschwert robuste statistische Leistungstests. Durch die Digitalisierung von Daten aus der jüngsten Arbeit von Huang und Kollegen, die einer von mehreren Berichten ist, die einen Zytokinsturm bei kritisch kranken COVID-Patienten zeigen, wurde jedoch eine Beispielrechnung auf der Grundlage ihrer IL-1b, IL-2, IL-10 und TNF-α erstellt Daten bereitgestellt werden. Die unten aufgeführten Leistungsberechnungen beziehen sich auf nichtparametrische Mann-Whitney-U-Tests unabhängiger Stichproben und wurden in G*power (V3.1.9.1) durchgeführt:

IL-1: Dies war im Bericht von Huang und Kollegen nicht wesentlich anders (Huang et al., 2020).

IL-2: Mit dem von Huang und Kollegen abgeleiteten geschätzten Mittelwert ± SD von 9,5 ± 4,3 und 6,7 ± 4,3 pg/ml von IL-2 bei kritisch kranken versus nicht kritisch kranken COVID-19-Patienten, ~40 Patienten pro Gruppe (80 total) benötigt, um einen Unterschied zu erkennen (Potenz = 0,80, Alpha = 0,05)

IL-6: Dies wurde von Huang und Kollegen nicht gemessen (Huang et al., 2020), jedoch konnten Ruan und Kollegen bei einer Stichprobengröße von insgesamt 150 Patienten signifikante Unterschiede in den IL-6-Spiegeln feststellen (Ruan et al ., 2020).

IL-10: Mit dem von Huang und Kollegen abgeleiteten geschätzten Mittelwert ± Standardabweichung von 19,5 ± 39,6 und 5,3 ± 4,3 pg/ml IL-10 bei kritisch kranken versus nicht kritisch kranken COVID-19-Patienten, ~60 Patienten pro Gruppe (insgesamt 120) wären erforderlich, um einen Unterschied zu erkennen (Stärke = 0,80, Alpha = 0,05).

TNF-α: Mit dem von Huang und Kollegen abgeleiteten geschätzten Mittelwert ± Standardabweichung von 93,2 ± 20,8 und 71,7 ± 21,4 pg/ml TNF-α bei kritisch kranken versus nicht kritisch kranken COVID-19-Patienten, ~17 Patienten pro Gruppe (insgesamt 34) wären erforderlich, um einen Unterschied zu erkennen (Stärke = 0,80, Alpha = 0,05)

Angesichts der oben vorgestellten Schätzungen der Stichprobengröße, der Tatsache, dass auch von Ruan und Kollegen ein deutlicher Unterschied bei IL-6 gemeldet wurde, und der erwarteten Aufnahmerate von COVID-19-Patienten in den nächsten Monaten wollen wir bis zu 150 Patienten rekrutieren.

Als Signifikanzschwelle für differentiell regulierte RNAs werden eine log2-fache Änderung > 1 und ein angepasster p-Wert von < 0,05 verwendet. Die Ingenuity Pathway Analysis wird verwendet, um kausale Netzwerke zu identifizieren, wobei die weitere Analyse auf einen Schwellenwert von einem negativen log p-Wert > 20 eingestellt wird. Wir werden die Filter „Antimikrobielle Reaktion“, „Entzündliche Reaktion“ und „Infektionskrankheit“ verwenden, um SARS-CoV-2-relevante RNAs zu identifizieren. Heatmaps werden durch Vergleichsanalysen generiert.

Analyseplan

Primär: Wir werden die Zytokinspiegel zwischen Patienten vergleichen, die ARDS entwickeln, und solchen, die dies nicht tun. Wir verwenden t-Tests unabhängiger Stichproben, wenn die Daten normal sind (bestimmt durch den Shapiro-Wilks-Test), oder Mann-Whitney-U-Tests, wenn die Daten nicht normalverteilt sind.

A-priori-Analyse: Wir werden die Wirkungen von Immunsuppressiva oder antiviralen Medikamenten, die im Rahmen der klinischen Versorgung verabreicht werden, auf physiologische Ergebnisse und die Veränderungen der Serum-Biomarker bewerten.

Sekundär: In explorativen Analysen, die darauf abzielen, unser sekundäres Ziel zu erreichen, werden wir unsere täglichen Zytokinmessungen verwenden, um festzustellen, ob es Zytokinschwellenwerte gibt, die mit der Entwicklung von ARDS bei COVID-19-Patienten verbunden sind.

Verschachtelte gematchte Kohortenstudie:

1. Untersuchen Sie die Unterschiede in den beatmungsfreien Tagen in den Tocilizumab- (im Rahmen der klinischen Versorgung verabreichten) und unterstützenden Gruppen mithilfe eines zweiseitigen t-Tests bei unabhängigen Stichproben.
2. Untersuchen Sie die Unterschiede in den kardiorespiratorischen physiologischen Ergebnissen (PaO2/FiO2, mittlerer arterieller Druck und Herzfrequenz) in der Tocilizumab-Gruppe (verabreicht als Teil der klinischen Behandlung) und den unterstützenden Gruppen mithilfe von zweiseitigen t-Tests mit unabhängigen Stichproben.
3. Untersuchen Sie die Unterschiede bei entzündlichen Zytokinen im Serum in Tocilizumab (verabreicht als Teil der klinischen Behandlung) und unterstützenden Gruppen unter Verwendung zweiseitiger t-Tests mit unabhängigen Stichproben.