Badanie roli biomarkerów w przewidywaniu wyniku COVID 19

CELE

1. Określenie częstości występowania hiperzapalnego fenotypu „burzy cytokin” COVID-19 u pacjentów w Vancouver General Hospital
2. Określ potencjalne powiązania między burzą cytokinową a ARDS u pacjentów z COVID-19
3. Sprofiluj pacjentów z łagodną i ciężką chorobą, próbując zidentyfikować biomarkery, które można przekształcić w szybki test do segregacji pacjentów wymagających pilnej opieki od tych, którzy wyzdrowieją samodzielnie
4. Wyjaśnij wpływ zmienności genetycznej na wyniki kliniczne COVID-19
5. Zidentyfikuj RNA istotne dla SARS-CoV-2
6. Określenie różnic w poziomach fizjologicznych i cytokin przed i po leczeniu pacjentów terapiami immunomodulującymi w ramach opieki klinicznej nad pacjentami z COVID-19.

HIPOTEZY

1. Pierwotny: Na podstawie wcześniejszych doniesień około 50% pacjentów z COVID-19 będzie wykazywać fenotyp burzy cytokinowej
2. Drugorzędowe: a) Pacjenci wykazujący burzę cytokin będą wykazywać większą częstość występowania ARDS b) Zidentyfikujemy biomarkery do szybkich testów c) Zmienność genu gospodarza wpłynie na wynik kliniczny zakażenia COVID-19

UZASADNIENIE

Nowy ludzki koronawirus 2019, pierwotnie nazwany 2019-nCoV, a obecnie określany jako koronawirus-2 zespołu ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2), powstał w Wuhan w prowincji Hubei w Chinach pod koniec grudnia 2019 r. Wirus ten powoduje chorobę znaną obecnie jako COVID-19. Po odkryciu SARS-CoV-2 zsekwencjonowano jego genom i określono receptor wejścia do komórki. Jego szybkie rozprzestrzenianie się na całym świecie i dowody na przenoszenie przez społeczność wskazują na prawdopodobny przedłużający się wpływ na nasz system opieki zdrowotnej i gospodarkę. Wymaga to skoordynowanej reakcji pracowników służby zdrowia i naukowców w celu rozpoznania strategii leczenia i zarządzania terapeutycznego COVID-19.

Poza wysiłkami na rzecz rozwoju szczepionek i leków przeciwwirusowych, nacisk na nowe interwencje terapeutyczne był stosunkowo minimalny, a do tej pory niewiele było raportów z badań klinicznych, które wywołały wezwanie do działania w celu zbadania terapii ukierunkowanych na gospodarza, oprócz innych strategii terapeutycznych. Ostatnio opublikowane opisy kliniczne tej choroby wskazują, że wielu pacjentów cierpi zarówno na stan hiperzapalny, określany jako „burza cytokin”, z późniejszą śmiercią, często przypisywaną rozwojowi zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Jednak chociaż burza cytokinowa wydaje się być związana z ciężkością choroby, nie ustalono jeszcze kluczowych powiązań między występowaniem burzy cytokinowej a rozwojem ARDS, który jest obecnie odpowiedzialny za największą część zgonów z powodu COVID-19. Określenie takiego powiązania i ustalenie kliniczne hiperzapalnego (tj. burza cytokinowa) zapewniłaby pierwszeństwo określonym terapiom przeciwzapalnym w celu zmniejszenia częstości ARDS i śmiertelności związanych z COVID-19, ponieważ kwestia ta pozostaje obecnie przedmiotem dyskusji.

Analizy CyTOF: to jednokomórkowe narzędzie proteomiczne, które zostanie zastosowane przy użyciu niestandardowego panelu 31 przeciwciał monoklonalnych, które opracowaliśmy dla możliwie najszerszej gamy komórek linii krwi. McNagny opracował tę technologię jako platformę dla AllerGEN NCE (zastępca dyrektora naukowego tego NCE). Identyfikuje, z niespotykaną dotąd szczegółowością, rzadkie podzbiory dojrzałej krwi i komórek progenitorowych. Obejmuje markery wrodzonych komórek limfoidalnych (ILC), które odgrywają ważną rolę w pobudzaniu odpowiedzi immunologicznych, a także prekursorów komórek krwi szpiku kostnego. Zarówno przewlekły stan zapalny, jak i ciężki ostry stan zapalny prowadzą do szybkiego wzrostu produkcji komórek zapalnych i przedwczesnego uwalniania komórek progenitorowych szpiku kostnego. Panel został zweryfikowany wewnętrznie i wykazał przydatność w identyfikacji dorosłych pacjentów z przewlekłą chorobą alergiczną, populacji, która wydaje się być bardziej narażona na infekcje dróg oddechowych. Celem będzie profilowanie pacjentów z łagodną i ciężką postacią choroby w celu zidentyfikowania biomarkerów, które można by przekształcić w szybki test do segregacji pacjentów wymagających pilnej opieki od tych, którzy wyzdrowieją samodzielnie.

Testy genetyczne: Autorzy wykazali, że różnice genetyczne żywiciela mają znaczący wpływ na wyniki kliniczne sepsy. Na przykład wykazaliśmy, że pojedynczy wariant nukleotydu w genie CETP ponad dwukrotnie zwiększa ryzyko 28-dniowej śmiertelności z powodu sepsy. Hipoteza jest taka, że ​​podobnie jak w przypadku innych postaci poważnych chorób, zmienność genów gospodarza będzie również wpływać na wynik kliniczny zakażenia COVID-19. Ta praca ma na celu wyjaśnienie wpływu zmienności genetycznej na wyniki kliniczne COVID-19.

Testowanie RNA: Krążące bezkomórkowe gatunki RNA są zazwyczaj zamknięte w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV), które chronią je przed degradacją w płynach ustrojowych. Obecna jest szeroka gama krążących biotypów RNA, przy czym mikro RNA (miRNA) są najlepiej badaną klasą. Te i inne krążące RNA mogą uczestniczyć w komunikacji między komórkami, mogą ulegać różnej ekspresji u pacjentów w porównaniu z grupą kontrolną i mogą być związane z postępem choroby, rozprzestrzenianiem się lub odpowiedziami na leki w różnych wskazaniach doraźnych i krytycznych, w tym posocznicy, neurotraumy i choroby układu krążenia.

Warunki są zoptymalizowane w celu uzyskania wiarygodnych i pełnych danych dotyczących krążącego RNA z minimalnych objętości wejściowych ludzkiego osocza lub surowicy. Wstępne badania z użyciem 200 ul surowicy dały ~15 ng RNA, wyraźnie przekraczając minimalny wkład 100 pg do wygenerowania bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji. Analiza pilotażowa od 3 zdrowych ludzkich dawców ochotników spełniła kryteria jakości przekraczające 10 mln odczytów/próbkę i potwierdziła, że ​​98% egzosomalnych miRNA zostało wykrytych w łącznej liczbie sygnatur średnio 359 miRNA. Co ważne, ta metoda dostarcza również danych na temat całego krajobrazu transkrypcyjnego potencjalnie informacyjnych krążących RNA z objętości próbek bardzo wykonalnych do badań klinicznych. Dalsze badania optymalizacyjne z wykorzystaniem zarówno surowicy, jak i osocza od jednego dawcy ludzkiego wykazały, że dobrej jakości dane RNA można uzyskać już z objętości wejściowej wynoszącej zaledwie 50 µl oraz że stwierdzono oczekiwane rozkłady biotypów RNA zarówno w surowicy, jak i w osoczu

CELE

Lepiej zrozumieć 1) powiązania między burzą cytokinową a ARDS u pacjentów z COVID-19 2) profil biomarkerów pacjentów z COVID-19 z łagodną i ciężką chorobą 3) wpływ zmienności genetycznej na wyniki kliniczne u pacjentów z COVID-19

PROJEKT BADAWCZY

Przegląd

Pacjenci przyjęci na oddział intensywnej terapii (OIOM) i oddział intensywnej terapii (HAU) w Vancouver General Hospital (VGH) lub Surrey Memorial Hospital (SMH) z podejrzeniem COVID-19 zostaną poddani kwarantannie w izolatce. Tutaj zostaną pobrane próbki do laboratoryjnego potwierdzenia SARS-CoV-2. Rozpocznie się opieka kliniczna, która będzie prowadzona według uznania lekarzy prowadzących zgodnie z aktualną procedurą operacyjną VGH/VCH dotyczącą zarządzania COVID-19.

Po rozpoczęciu opieki klinicznej próbki krwi zostaną pobrane w dniach 1-7, 10, 14 i 21 po przyjęciu na OIOM/HAU przez personel kliniczny OIOM/HAU do probówek vacutainer do oddzielania surowicy (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinsona). Próbki te zostaną przeanalizowane pod kątem panelu cytokin, markerów stanu zapalnego, CyTOF, RNA i testów genetycznych. Analizy zostaną przeprowadzone w 1) laboratorium dr Cheryl Wellington w David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) w laboratorium dr Kelly McNagny, DMCBH, UBC., 3) w laboratorium dr. Laboratorium Liama ​​​​Brunhama w Centrum Innowacji Płuc Serca (HLI), Szpital św. Pawła.

Zagnieżdżone dopasowane badanie kohortowe zostanie przeprowadzone w celu zbadania zmian zmian liczby dni bez respiratora, PaO2/FiO2 i cytokin zapalnych przed podaniem terapii immunomodulujących, które są podawane w ramach rutynowej opieki klinicznej nad zespołem burzy cytokinowej.

ANALIZA STATYSTYCZNA

Niedawny wybuch tej choroby utrudnia solidne testowanie mocy statystycznej. Jednak dzięki digitalizacji danych z ostatniej pracy Huanga i jego współpracownika, która jest jednym z kilku raportów wykazujących burzę cytokinową u krytycznie chorych pacjentów z COVID, przykładowe obliczenia oparte na ich IL-1b, IL-2, IL-10 i TNF-α podane są dane. Przedstawione poniżej obliczenia mocy są dla niezależnych próbek nieparametrycznym testem U Manna-Whitneya i zostały przeprowadzone w G*power (V3.1.9.1):

IL-1: Nie różniło się to istotnie w raporcie Huanga i współpracowników (Huang i in., 2020).

IL-2: Z oszacowaną średnią ± SD pochodzącą z Huanga i współpracowników wynoszącą 9,5 ± 4,3 i 6,7 ± 4,3 pg/ml IL-2 u pacjentów z COVID-19 krytycznie chorych w porównaniu z niekrytycznie chorymi, ~40 pacjentów na grupę (80 total) byłby potrzebny do wykrycia różnicy (moc = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: Nie zostało to zmierzone przez Huanga i współpracowników (Huang i in., 2020), jednak przy próbie obejmującej łącznie 150 pacjentów Ruan i współpracownicy byli w stanie wykryć znaczące różnice w poziomach IL-6 (Ruan i in. ., 2020).

IL-10: Z oszacowaną średnią ± SD pochodzącą z Huanga i współpracowników wynoszącą 19,5 ± 39,6 i 5,3 ± 4,3 pg/ml IL-10 u krytycznie chorych i niekrytycznie chorych pacjentów z COVID-19, potrzebnych byłoby ~60 pacjentów na grupę (łącznie 120), aby wykryć różnicę (moc = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: z oszacowaną średnią ± SD pochodzącą z Huanga i współpracowników wynoszącą 93,2 ± 20,8 i 71,7 ± 21,4 pg/ml TNF-α u krytycznie chorych i niekrytycznie chorych pacjentów z COVID-19, potrzeba ~17 pacjentów na grupę (łącznie 34), aby wykryć różnicę (moc = 0,80, alfa = 0,05)

Biorąc pod uwagę przedstawione powyżej szacunki wielkości próby, że wyraźną różnicę w IL-6 zgłosili również Ruan i współpracownicy, oraz przewidywany wskaźnik przyjęć pacjentów z COVID-19 w ciągu najbliższych kilku miesięcy, naszym celem jest rekrutacja do 150 pacjentów.

Log2-krotna zmiana >1 i dostosowana wartość p <0,05 zostaną użyte jako próg istotności dla RNA regulowanych w różny sposób. Analiza ścieżki pomysłowości zostanie wykorzystana do zidentyfikowania sieci przyczynowych, przy czym dalsza analiza zostanie ustawiona na progu ujemnej logarytmicznej wartości p >20. Użyjemy filtrów odpowiedzi przeciwdrobnoustrojowej, odpowiedzi zapalnej i choroby zakaźnej, aby zidentyfikować RNA istotne dla SARS-CoV-2. Mapy cieplne zostaną wygenerowane na podstawie analizy porównawczej.

Plan analizy

Podstawowy: Porównamy poziomy cytokin u pacjentów, u których rozwinął się ARDS i u tych, u których nie występuje. Użyjemy testów t niezależnych próbek w danych, które są normalne (określone za pomocą testu Shapiro Wilksa) lub testów Manna-Whitneya-U, jeśli dane nie mają rozkładu normalnego.

Analiza a priori: Ocenimy wpływ leków immunosupresyjnych lub przeciwwirusowych podawanych w ramach opieki klinicznej na wyniki fizjologiczne i zmiany biomarkerów w surowicy.

Wtórne: W analizach eksploracyjnych, których celem jest osiągnięcie naszego drugorzędnego celu, wykorzystamy nasze codzienne pomiary cytokin, aby określić, czy istnieją progi cytokin, które są związane z rozwojem ARDS u pacjentów z COVID-19.

Zagnieżdżone dopasowane badanie kohortowe:

1. Zbadaj różnice w dniach bez respiratora w grupie tocilizumabu (podawanego w ramach opieki klinicznej) i grupie wspierającej za pomocą dwustronnego testu t dla niezależnych próbek.
2. Zbadaj różnice w fizjologicznych wynikach krążeniowo-oddechowych (PaO2/FiO2, średnie ciśnienie tętnicze i częstość akcji serca) w grupie otrzymującej tocilizumab (podawany w ramach opieki klinicznej) i grupie wspierającej za pomocą dwustronnych testów t dla niezależnych próbek.
3. Zbadaj różnice w stężeniu cytokin zapalnych w surowicy w grupach otrzymujących tocilizumab (podawany w ramach opieki klinicznej) iw grupach wspomagających za pomocą dwustronnych testów t niezależnych próbek.