Undersøker rollen til biomarkører i å forutsi utfall for COVID 19

FORMÅL

1. Bestem utbredelsen av en COVID-19 hyperinflammatorisk "cytokinstorm" fenotype hos pasienter ved Vancouver General Hospital
2. Bestem eventuelle koblinger mellom cytokinstorm og ARDS hos COVID-19-pasienter
3. Profil pasienter med mild og alvorlig sykdom i et forsøk på å identifisere biomarkører som kan utvikles til en hurtigtest for triaging pasienter som trenger akutt behandling fra de som vil komme seg av seg selv
4. Belyse virkningen av genetisk variasjon på kliniske utfall fra COVID-19
5. Identifiser SARS-CoV-2 relevante RNA
6. For å bestemme forskjeller i fysiologiske nivåer og cytokinnivåer før og etter at pasienter behandles med immunmodulerende terapier som en del av klinisk behandling hos COVID-19-pasienter.

HYPOTESER

1. Primær: Basert på tidligere rapporter, vil omtrent 50 % av COVID-19-pasienter demonstrere en cytokinstormfenotype
2. Sekundært: a) Pasienter som viser cytokinstorm vil demonstrere en høyere forekomst av ARDS b) Vi vil identifisere biomarkører for rask testing c) Vertsgenvariasjon vil påvirke det kliniske resultatet fra COVID-19-infeksjon

BERETTIGELSE

Det nye humane koronaviruset fra 2019, opprinnelig kalt 2019-nCoV, og nå referert til som det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus-2 (SARS-CoV-2), oppsto i Wuhan i Hubei-provinsen i Kina sent i desember 2019. Dette viruset forårsaker sykdommen nå kjent som COVID-19. Etter oppdagelsen har SARS-CoV-2 siden fått sitt genom sekvensert og celleinngangsreseptor bestemt. Den raske globale spredningen og bevis på overføring av lokalsamfunn indikerer en sannsynlig langvarig innflytelse på helsevesenet og økonomien vår. Dette krever en koordinert respons fra helsepersonell og forskere for å finne strategier for behandling og terapeutisk håndtering av COVID-19.

Utenom vaksine- og antiviral utviklingsarbeid har fokuset på nye terapeutiske intervensjoner vært relativt minimalt, med få kliniske utprøvingsrapporter til dags dato, noe som har fremkalt en oppfordring til handling for å utforske vertsrettede terapier i tillegg til andre terapeutiske strategier. Nylig publiserte kliniske beskrivelser av denne sykdommen har indikert at mange pasienter lider av både en hyperinflammatorisk tilstand, referert til som en "cytokinstorm" med påfølgende død som ofte kan tilskrives utviklingen av akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS). Imidlertid, mens cytokinstorm ser ut til å være assosiert med sykdommens alvorlighetsgrad, har nøkkelkoblinger mellom tilstedeværelsen av cytokinstorm og utvikling av ARDS, som for tiden er ansvarlig for den største andelen av COVID-19-dødsfall, ennå ikke blitt etablert. Avgrensning av en slik kobling og klinisk etablering av en hyperinflammatorisk (dvs. cytokinstorm) fenotype vil gi forrang for spesifikke antiinflammatoriske behandlinger for å redusere forekomsten av COVID-19-assosiert ARDS og dødelighet, da dette fortsatt diskuteres for tiden.

CyTOF-analyser: er et enkeltcelle-proteomisk verktøy som vil bli brukt ved hjelp av et tilpasset panel av 31 monoklonale antistoffer vi utviklet til et bredest mulig utvalg av blodceller. McNagny utviklet denne teknologien som en plattform for AllerGEN NCE (Associate Scientific Director for denne NCE). Den identifiserer, i enestående detalj, sjeldne undergrupper av modne blod- og stamceller. Det inkluderer markører for medfødte lymfoide celler (ILCs) som spiller potente roller i priming immunresponser og også benmargsblodcelleforløpere. Kronisk betennelse og alvorlig akutt betennelse fører begge til en rask økning av inflammatorisk celleproduksjon og for tidlig frigjøring av benmargsforløpere. Panelet har blitt internt validert og vist nytte for å identifisere voksne pasienter med kronisk allergisk sykdom, en populasjon som ser ut til å være mer alvorlig påvirket av luftveisinfeksjoner. Det vil være et mål å profilere pasienter med mild og alvorlig sykdom i et forsøk på å identifisere biomarkører som kan utvikles til en hurtigtest for triagering av pasienter som trenger akutthjelp fra de som vil bli friske av seg selv.

Genetisk testing: Forfattere har vist at vertsgenetiske forskjeller har en betydelig innvirkning på de kliniske resultatene av sepsis. For eksempel har vi vist at en enkelt nukleotidvariant i CETP-genet mer enn dobler risikoen for 28-dagers dødelighet fra sepsis. Hypotesen er at i likhet med andre former for kritisk sykdom, vil vertsgenvariasjon også påvirke det kliniske resultatet av COVID-19-infeksjon. Dette arbeidet er utformet for å belyse virkningen av genetisk variasjon på kliniske utfall fra COVID-19.

RNA-testing: Sirkulerende cellefrie RNA-arter er vanligvis innkapslet i ekstracellulære vesikler (EV) som beskytter dem mot nedbrytning i kroppsvæsker. Et bredt utvalg av sirkulerende RNA-biotyper er til stede, med mikro-RNA (miRNA) som den mest studerte klassen. Disse og andre sirkulerende RNA-er kan delta i celle-til-celle-kommunikasjon, kan uttrykkes forskjellig hos pasienter sammenlignet med kontroller, og kan assosieres med sykdomsprogresjon, spredning eller medikamentresponser i en rekke akutte og kritiske behandlingsindikasjoner, inkludert sepsis, neurotrauma og hjerte- og karsykdommer.

Forholdene er optimalisert for å oppnå pålitelige og fullstendige sirkulerende RNA-data fra minimale inngangsvolumer av humant plasma eller serum. Innledende studier med 200 ul serum ga ~15 ng RNA, som klart oversteg den minimale inngangen på 100 pg for å generere biblioteker for neste generasjons sekvensering. Pilotanalyse fra 3 friske frivillige donorer besto kvalitetskriterier som oversteg 10 millioner avlesninger/prøve og bekreftet at 98 % av eksosomale miRNA-er ble påvist i totale signaturer av gjennomsnittlig 359 miRNA. Viktigere er at denne metoden også gir data om hele det transkripsjonelle landskapet av potensielt informative sirkulerende RNA-er fra prøvevolumer som er svært gjennomførbare for kliniske studier. Ytterligere optimaliseringsstudier ved bruk av både serum og plasma fra en enkelt menneskelig donor viste at RNA-data av god kvalitet kunne oppnås fra så lite som 50 µl inngangsvolum og at de forventede RNA-biotypefordelingene ble funnet for både serum og plasma

MÅL

Forstå bedre 1) koblingene mellom cytokinstorm og ARDS hos COVID-19-pasienter 2) biomarkørprofilen til COVID-19-pasienter med mild og alvorlig sykdom 3) virkningen av genetisk variasjon på kliniske utfall hos COVID-19-pasienter

FORSKNINGSDESIGN

Oversikt

Pasienter innlagt på intensivavdelingen (ICU) og High Acuity Unit (HAU) ved Vancouver General Hospital (VGH) eller Surrey Memorial Hospital (SMH) med mistenkt covid-19 vil bli satt i karantene i en isolasjonsavdeling. Her vil det bli samlet inn prøver for laboratoriebekreftelse av SARS-CoV-2. Klinisk behandling vil starte og styres av behandlende legers skjønn i henhold til VGH/VCHs gjeldende operasjonsprosedyre for håndtering av COVID-19.

Når klinisk behandling har startet, vil en blodprøve bli tatt på dag 1-7, 10, 14 og 21 etter ICU/HAU-innleggelse av klinisk personale på ICU/HAU i vacutainer serumseparatorrør (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Disse prøvene vil bli analysert for et panel av cytokiner, inflammatoriske markører, CyTOF, RNA og genetisk testing. Analyser vil bli utført ved 1)Dr Cheryl Wellingtons laboratorium ved David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2)Dr. Kelly McNagnys laboratorium, DMCBH, UBC., 3)Dr. Liam Brunhams laboratorium ved Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

En nestet matchet kohortstudie vil bli utført for å undersøke endringene i endringene i respiratorfrie dager, PaO2/FiO2 og inflammatoriske cytokiner før etter administrering av immunmodulerende terapier som er administrering som en del av rutinemessig klinisk behandling for cytokinstormsyndrom.

STATISTISK ANALYSE

Nyheten av dette sykdomsutbruddet gjør robust statistisk krafttesting vanskelig. Men ved å digitalisere data fra Huang og kollegas nylige arbeid, som er en av flere rapporter som demonstrerer cytokinstorm hos kritisk syke COVID-pasienter, en prøveberegning basert på deres IL-1b, IL-2, IL-10 og TNF-α data er gitt. De nedenfor presenterte effektberegningene er for uavhengige prøver, ikke-parametrisk Mann-Whitney-U-test og ble utført i G*power (V3.1.9.1):

IL-1: Dette var ikke signifikant forskjellig i rapporten fra Huang og medarbeidere (Huang et al., 2020).

IL-2: Med det estimerte gjennomsnittet±SD avledet fra Huang og kolleger på 9,5±4,3 og 6,7±4,3 pg/mL IL-2 hos kritisk syke versus ikke-kritisk syke COVID-19-pasienter, ~40 pasienter per gruppe (80 totalt) ville være nødvendig for å oppdage en forskjell (effekt = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: Dette ble ikke målt av Huang og kolleger (Huang et al., 2020), men med en prøvestørrelse på totalt 150 pasienter, klarte Ruan og kollegaer å oppdage signifikante forskjeller i IL-6-nivåer (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: Med estimert gjennomsnitt±SD avledet fra Huang og kolleger på 19,5±39,6 og 5,3±4,3 pg/mL IL-10 hos kritisk syke versus ikke-kritisk syke COVID-19-pasienter, ville ~60 pasienter per gruppe (totalt 120) være nødvendig for å oppdage en forskjell (styrke = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: Med estimert gjennomsnitt±SD avledet fra Huang og kolleger på 93,2±20,8 og 71,7±21,4 pg/mL TNF-α hos kritisk syke versus ikke-kritisk syke COVID-19-pasienter, ville ~17 pasienter per gruppe (totalt 34) være nødvendig for å oppdage en forskjell (styrke = 0,80, alfa = 0,05)

Gitt de ovenfor presenterte prøvestørrelsesestimatene, at en markant forskjell i IL-6 også ble rapportert av Ruan og kolleger, og den forventede innleggelsesraten for COVID-19-pasienter i løpet av de neste månedene, tar vi sikte på å rekruttere opptil 150 pasienter.

En log2-fold endring >1 og en justert p-verdi på <0,05 vil bli brukt som terskel for signifikans for differensielt regulerte RNA. Oppfinnsomhet Pathway Analysis vil bli brukt til å identifisere kausale nettverk, med videre analyse satt til en terskel på en negativ log p-verdi >20. Vi vil bruke filtrene for antimikrobiell respons, inflammatorisk respons og infeksjonssykdom for å identifisere SARS-CoV-2-relevante RNA-er. Varmekart vil bli generert ved sammenligningsanalyse.

Analyseplan

Primær: Vi vil sammenligne nivåene av cytokiner mellom pasienter som utvikler ARDS og de som ikke gjør det. Vi vil bruke uavhengige samples t-tester i dataene er normale (bestemt via Shapiro Wilks test), eller Mann-Whitney-U tester hvis dataene ikke er normalfordelt.

A priori-analyse: Vi vil vurdere effekten av immunsuppressive eller antivirale medisiner gitt som en del av klinisk omsorg ut fysiologiske utfall og endringene i serumbiomarkørene.

Sekundært: I eksplorative analyser som tar sikte på å oppfylle vårt sekundære mål, vil vi bruke våre daglige cytokinmål for å finne ut om det er cytokinterskler som er assosiert med utviklingen av ARDS hos COVID-19-pasienter.

Nestet matchet kohortstudie:

1. Undersøk forskjellene i de respiratorfrie dagene i tocilizumab (administrert som en del av klinisk behandling) og støttende grupper ved å bruke en uavhengig to-halet t-test.
2. Undersøk forskjellene i kardiorespiratoriske fysiologiske utfall (PaO2/FiO2, gjennomsnittlig arterielt trykk og hjertefrekvens) i tocilizumab (administrert som en del av klinisk behandling) og støttende grupper ved å bruke uavhengige to-halede t-tester.
3. Undersøk forskjellene i serum inflammatoriske cytokiner i tocilizumab (administrert som en del av klinisk behandling) og støttende grupper ved å bruke uavhengige prøver med tosidede t-tester.