Zkoumání role biomarkerů při předpovídání výsledku COVID 19

ÚČELY

1. Určete prevalenci hyperzánětlivého fenotypu „cytokinové bouře“ COVID-19 u pacientů ve Vancouver General Hospital
2. Určete jakékoli potenciální souvislosti mezi cytokinovou bouří a ARDS u pacientů s COVID-19
3. Profilujte pacienty s mírným a závažným onemocněním ve snaze identifikovat biomarkery, které by mohly být vyvinuty do rychlého testu pro třídění pacientů, kteří vyžadují naléhavou péči od těch, kteří se sami uzdraví
4. Objasněte dopad genetických variací na klinické výsledky COVID-19
5. Identifikujte RNA relevantní pro SARS-CoV-2
6. Zjistit rozdíly ve fyziologických hladinách a hladinách cytokinů před a po léčbě pacientů imunomodulačními terapiemi v rámci klinické péče u pacientů s COVID-19.

HYPOTÉZY

1. Primární: Na základě předchozích zpráv bude přibližně 50 % pacientů s COVID-19 vykazovat fenotyp cytokinové bouře
2. Sekundární: a)Pacienti vykazující cytokinovou bouři prokážou vyšší výskyt ARDS b)Identifikujeme biomarkery pro rychlé testování c)Variace hostitelského genu ovlivní klinický výsledek infekce COVID-19

ODŮVODNĚNÍ

Nový lidský koronavirus z roku 2019, původně nazvaný 2019-nCoV a nyní označovaný jako koronavirus-2 těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoV-2), vznikl koncem prosince 2019 ve Wu-chanu v provincii Chu-pej v Číně. Tento virus způsobuje onemocnění nyní známé jako COVID-19. Po svém objevu má SARS-CoV-2 od té doby sekvenovaný genom a určen receptor pro vstup do buňky. Jeho rychlé globální rozšíření a důkazy o komunitním přenosu ukazují na pravděpodobný dlouhodobý vliv na náš systém zdravotní péče a ekonomiku. To vyžaduje koordinovanou reakci zdravotnických pracovníků a vědců, aby bylo možné rozpoznat strategie pro léčbu a terapeutické řízení COVID-19.

Mimo úsilí o vývoj vakcín a antivirotik bylo zaměření na nové terapeutické intervence poměrně minimální, s několika zprávami o klinických studiích k dnešnímu dni, což vyvolalo výzvu k akci k prozkoumání hostitelsky řízených terapií kromě jiných terapeutických strategií. Nedávno publikované klinické popisy tohoto onemocnění ukázaly, že mnoho pacientů trpí jak hyper-zánětlivým stavem, označovaným jako "cytokinová bouře" s následnou smrtí často připisovanou rozvoji syndromu akutní respirační tísně (ARDS). I když se však zdá, že cytokinová bouře souvisí se závažností onemocnění, klíčové souvislosti mezi přítomností cytokinové bouře a rozvojem ARDS, která je v současnosti zodpovědná za největší podíl úmrtí na COVID-19, musí být teprve stanovena. Vymezení takového spojení a klinické stanovení hyperzánětlivého (tj. fenotyp cytokinové bouře) by poskytl přednost specifické protizánětlivé léčbě, aby se snížil výskyt ARDS a úmrtnosti související s COVID-19, protože o tom se v současnosti diskutuje.

CyTOF analýzy: je jednobuněčný proteomický nástroj, který bude aplikován pomocí vlastního panelu 31 monoklonálních protilátek, které jsme vyvinuli pro nejširší možné pole krevních linií buněk. McNagny vyvinul tuto technologii jako platformu pro AllerGEN NCE (Associate Scientific Director of this NCE). V bezprecedentních detailech identifikuje vzácné podskupiny zralých krevních a progenitorových buněk. Zahrnuje markery vrozených lymfoidních buněk (ILC), které hrají silnou roli při aktivaci imunitních reakcí, a také progenitory krevních buněk kostní dřeně. Chronický zánět i těžký akutní zánět vedou k rychlému nárůstu produkce zánětlivých buněk a předčasnému uvolnění progenitorů kostní dřeně. Panel byl interně ověřen a prokázal svou užitečnost při identifikaci dospělých pacientů s chronickým alergickým onemocněním, což je populace, která se zdá být vážněji zasažena respiračními infekcemi. Cílem bude profilovat pacienty s mírným a těžkým onemocněním ve snaze identifikovat biomarkery, které by mohly být vyvinuty do rychlého testu pro třídění pacientů, kteří vyžadují naléhavou péči, od těch, kteří se uzdraví sami.

Genetické testování: Autoři prokázali, že genetické rozdíly hostitele mají významný vliv na klinické výsledky sepse. Například jsme ukázali, že jediná nukleotidová varianta v genu CETP více než zdvojnásobuje riziko 28denní úmrtnosti na sepsi. Hypotéza je taková, že podobně jako u jiných forem kritického onemocnění ovlivní variace hostitelského genu také klinický výsledek infekce COVID-19. Tato práce je navržena tak, aby objasnila dopad genetické variace na klinické výsledky COVID-19.

Testování RNA: Cirkulující bezbuněčné druhy RNA jsou typicky zapouzdřeny v extracelulárních vezikulách (EV), které je chrání před degradací v tělesných tekutinách. Je přítomna široká škála biotypů cirkulujících RNA, přičemž nejvíce studovanou třídou jsou mikro RNA (miRNA). Tyto a další cirkulující RNA se mohou podílet na komunikaci mezi buňkami, mohou být u pacientů odlišně exprimovány ve srovnání s kontrolami a mohou být spojeny s progresí onemocnění, šířením nebo reakcí na léky v různých indikacích akutní a kritické péče, včetně sepse, neurotrauma a kardiovaskulární onemocnění.

Podmínky jsou optimalizovány pro získání spolehlivých a úplných dat o cirkulující RNA z minimálních vstupních objemů lidské plazmy nebo séra. Počáteční studie s použitím 200 ul séra poskytly ~15 ng RNA, jasně překračující minimální vstup 100 pg pro vytvoření knihoven pro sekvenování další generace. Pilotní analýza od 3 zdravých lidských dobrovolných dárců splnila kritéria kvality přesahující 10M čtení/vzorek a potvrdila, že 98 % exosomálních miRNA bylo detekováno v celkových signaturách průměrně 359 miRNA. Důležité je, že tato metoda také poskytuje data o celém transkripčním prostředí potenciálně informativních cirkulujících RNA z objemů vzorků, které jsou velmi vhodné pro klinické studie. Další optimalizační studie využívající sérum i plazmu od jediného lidského dárce ukázaly, že kvalitní údaje o RNA lze získat již z 50 µl vstupního objemu a že byly nalezeny očekávané distribuce biotypů RNA pro sérum i plazmu.

CÍLE

Lépe porozumět 1) souvislostem mezi cytokinovou bouří a ARDS u pacientů s COVID-19 2) profilu biomarkerů pacientů s COVID-19 s mírným a závažným onemocněním 3) dopadu genetické variace na klinické výsledky u pacientů s COVID-19

DESIGN VÝZKUMU

Přehled

Pacienti přijatí na jednotku intenzivní péče (JIP) a jednotku vysoké ostrosti (HAU) ve Vancouver General Hospital (VGH) nebo Surrey Memorial Hospital (SMH) s podezřením na COVID-19 budou umístěni do karantény na izolační jednotce. Zde budou odebrány vzorky pro laboratorní potvrzení SARS-CoV-2. Klinická péče bude zahájena a bude se řídit uvážením ošetřujících lékařů v souladu s aktuálním operačním postupem VGH/VCH pro management COVID-19.

Jakmile bude zahájena klinická péče, vzorek krve bude odebrán ve dnech 1-7, 10, 14 a 21 po přijetí na JIP/HAU klinickým personálem na JIP/HAU do zkumavek pro separaci séra Vacutainer (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Tyto vzorky budou analyzovány na panel cytokinů, zánětlivých markerů, CyTOF, RNA a genetického testování. Analýzy budou provedeny v 1) laboratoři Dr. Cheryl Wellingtonové v David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) v laboratoři Dr. Kelly McNagnyové, DMCBH, UBC., 3) Dr. Laboratoř Liama ​​Brunhama v Center for Heart Lung Innovation (HLI), Nemocnice svatého Pavla.

Bude provedena vnořená shodná kohortová studie, která bude zkoumat změny ve změnách dnů bez ventilátoru, PaO2/FiO2 a zánětlivých cytokinů před podáním imunomodulačních terapií, které jsou podávány jako součást rutinní klinické péče o syndrom cytokinové bouře.

STATISTICKÁ ANALÝZA

Nedávný výskyt této choroby ztěžuje robustní statistické testování síly. Nicméně digitalizací dat z nedávné práce Huanga a kolegy, která je jednou z několika zpráv demonstrujících cytokinovou bouři u kriticky nemocných pacientů s COVID, byl vytvořen vzorový výpočet založený na jejich IL-1b, IL-2, IL-10 a TNF-α údaje jsou poskytovány. Níže uvedené výpočty výkonu jsou pro nezávislé vzorky neparametrický Mann-Whitney-U test a byly provedeny v G*power (V3.1.9.1):

IL-1: Toto se ve zprávě Huanga a kolegů významně nelišilo (Huang et al., 2020).

IL-2: S odhadovaným průměrem ± SD odvozeným od Huanga a kolegů 9,5 ± 4,3 a 6,7 ​​± 4,3 pg/ml IL-2 u kriticky nemocných versus nekriticky nemocných pacientů s COVID-19, ~ 40 pacientů na skupinu (80 celkem) by bylo potřeba ke zjištění rozdílu (výkon = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: Toto nebylo měřeno Huangem a kol. (Huang et al., 2020), nicméně s velikostí vzorku celkem 150 pacientů byli Ruan a kolegové schopni detekovat významné rozdíly v hladinách IL-6 (Ruan a kol. ., 2020).

IL-10: S odhadovaným průměrem ± SD odvozeným od Huanga a kolegů 19,5 ± 39,6 a 5,3 ± 4,3 pg/ml IL-10 u kriticky nemocných versus nekriticky nemocných pacientů s COVID-19 by k detekci rozdílu bylo zapotřebí ~60 pacientů na skupinu (celkem 120) (moc = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: S odhadovaným průměrem ± SD odvozeným od Huanga a kolegů 93,2 ± 20,8 a 71,7 ± 21,4 pg/ml TNF-α u kriticky nemocných versus nekriticky nemocných pacientů s COVID-19 by k detekci rozdílu bylo zapotřebí ~17 pacientů na skupinu (celkem 34) (moc = 0,80, alfa = 0,05)

Vzhledem k výše uvedeným odhadům velikosti vzorku, že výrazný rozdíl v IL-6 byl hlášen také Ruanem a jeho kolegy, a předpokládanou mírou přijetí pacientů s COVID-19 v příštích několika měsících, se snažíme získat až 150 pacientů.

Log2násobná změna >1 a upravená hodnota p <0,05 budou použity jako práh významnosti pro odlišně regulované RNA. Analýza cesty vynalézavosti bude použita k identifikaci kauzálních sítí, přičemž další analýza bude nastavena na prahovou hodnotu negativní hodnoty log p >20. K identifikaci RNA relevantních pro SARS-CoV-2 použijeme filtry Antimikrobiální odezva, Zánětlivá odezva a infekční onemocnění. Teplotní mapy budou generovány srovnávací analýzou.

Plán analýzy

Primární: Budeme porovnávat hladiny cytokinů mezi pacienty, u kterých se vyvine ARDS, a těmi, u kterých se nevyskytuje. Použijeme nezávislé vzorky t-testů v datech je normální (určeno pomocí Shapiro Wilks testu), nebo Mann-Whitney-U testy, pokud data nejsou normálně distribuována.

A priori analýza: Posoudíme účinky imunosupresivních nebo antivirových léků podávaných v rámci klinické péče z fyziologických výsledků a změn sérových biomarkerů.

Sekundární: V průzkumných analýzách zaměřených na splnění našeho sekundárního cíle využijeme naše denní měření cytokinů k určení, zda existují prahové hodnoty cytokinů, které jsou spojeny s rozvojem ARDS u pacientů s COVID-19.

Vnořená shodná kohortová studie:

1. Prověřte rozdíly ve dnech bez ventilátoru u tocilizumabu (podávaného jako součást klinické péče) a podpůrné skupiny pomocí nezávislého dvoustranného t-testu.
2. Prozkoumejte rozdíly v kardiorespiračních fyziologických výsledcích (PaO2/FiO2, střední arteriální tlak a srdeční frekvence) u tocilizumabu (podávaného jako součást klinické péče) a podpůrné skupiny pomocí nezávislých vzorků dvoustranných t-testů.
3. Prozkoumejte rozdíly v sérových zánětlivých cytokinech u tocilizumabu (podávaného jako součást klinické péče) a podpůrných skupin pomocí nezávislých vzorků dvoustranných t-testů.