COVID 19의 결과 예측에서 바이오마커의 역할 조사

목적

1. Vancouver General Hospital 환자의 COVID-19 과염증성 "사이토카인 폭풍" 표현형 유병률 확인
2. COVID-19 환자의 사이토카인 폭풍과 ARDS 간의 잠재적 연관성을 확인합니다.
3. 긴급한 치료가 필요한 환자와 스스로 회복할 환자를 분류하기 위한 신속한 테스트로 개발될 수 있는 바이오마커를 식별하기 위한 시도로 경증 및 중증 질환 환자 프로파일링
4. COVID-19의 임상 결과에 대한 유전적 변이의 영향을 설명합니다.
5. SARS-CoV-2 관련 RNA 식별
6. COVID-19 환자의 임상 치료의 일환으로 면역 조절 요법으로 환자를 치료하기 전과 후의 생리학적 및 사이토카인 수치의 차이를 확인합니다.

가설

1. 기본: 이전 보고서에 따르면 COVID-19 환자의 약 50%가 사이토카인 폭풍 표현형을 보일 것입니다.
2. 2차: a) 사이토카인 폭풍을 보이는 환자는 ARDS 발생률이 더 높을 것입니다. b) 신속한 테스트를 위한 바이오마커를 식별할 것입니다. c) 숙주 유전자 변이가 COVID-19 감염의 임상 결과에 영향을 미칠 것입니다.

정당화

원래 2019-nCoV로 명명된 2019년 신종 인간 코로나바이러스는 현재 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)로 불리며 2019년 12월 말 중국 후베이성 ​​우한에서 시작되었습니다. 이 바이러스는 현재 COVID-19로 알려진 질병을 유발합니다. SARS-CoV-2가 발견된 후 게놈 시퀀싱과 세포 진입 수용체가 결정되었습니다. 급속한 전 세계적 확산과 지역 사회 전파의 증거는 우리의 의료 시스템과 경제에 장기간 영향을 미칠 가능성이 있음을 나타냅니다. 이를 위해서는 COVID-19의 치료 및 치료 관리 전략을 식별하기 위해 의료 종사자와 과학자의 조율된 대응이 필요합니다.

백신 및 항바이러스 개발 노력 외에 새로운 치료적 개입에 대한 초점은 상대적으로 미미했으며 현재까지 임상 시험 보고서가 거의 없었기 때문에 다른 치료 전략과 함께 호스트 지정 요법을 탐색하기 위한 조치를 취해야 했습니다. 이 질병에 대한 최근 발표된 임상 설명에 따르면 많은 환자가 "사이토카인 폭풍"이라고 하는 과염증 상태와 종종 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)의 발달로 인한 후속 사망으로 고통받고 있습니다. 그러나 사이토카인 폭풍은 질병의 중증도와 관련이 있는 것으로 보이지만, 사이토카인 폭풍의 존재와 현재 COVID-19 사망의 가장 큰 비율을 차지하는 ARDS 발병 사이의 주요 연관성은 아직 확립되지 않았습니다. 과염증(즉, 사이토카인 폭풍) 표현형은 COVID-19 관련 ARDS의 발생률과 사망률을 줄이기 위한 특정 항염증 치료에 대한 우선 순위를 제공할 것입니다.

CyTOF 분석: 우리가 개발한 31개의 단클론 항체의 맞춤형 패널을 사용하여 가능한 가장 광범위한 혈통 세포 배열에 적용되는 단일 세포 프로테오믹 도구입니다. McNagny는 AllerGEN NCE(이 NCE의 Associate Scientific Director)를 위한 플랫폼으로 이 기술을 개발했습니다. 그것은 성숙한 혈액과 전구 세포의 희귀한 하위 집합을 전례 없이 자세히 식별합니다. 여기에는 면역 반응을 시작하는 데 강력한 역할을 하는 선천성 림프구 세포(ILC)의 마커와 골수 혈액 세포 전구체가 포함됩니다. 만성 염증과 중증 급성 염증은 모두 염증 세포 생산의 급속한 증가와 골수 전구체의 조기 방출로 이어집니다. 이 패널은 내부적으로 검증되었으며 호흡기 감염에 의해 더 심각한 영향을 받는 것으로 보이는 모집단인 만성 알레르기 질환이 있는 성인 환자를 식별하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 저절로 회복될 환자와 긴급 치료가 필요한 환자를 분류하기 위한 신속한 테스트로 개발될 수 있는 바이오마커를 식별하려는 시도에서 경증 및 중증 질환 환자를 프로파일링하는 목표가 있을 것입니다.

유전자 검사: 저자는 숙주의 유전적 차이가 패혈증의 임상 결과에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 우리는 CETP 유전자의 단일 뉴클레오티드 변이가 패혈증으로 인한 28일 사망 위험을 두 배 이상 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 가설은 다른 형태의 치명적인 질병과 마찬가지로 숙주 유전자 변이도 COVID-19 감염의 임상 결과에 영향을 미칠 것이라는 것입니다. 이 작업은 COVID-19의 임상 결과에 대한 유전적 변이의 영향을 설명하기 위해 고안되었습니다.

RNA 테스트: 순환하는 무세포 RNA 종은 일반적으로 체액의 분해로부터 보호하는 세포외 소포(EV)에 캡슐화됩니다. 다양한 순환 RNA 생물형이 존재하며 마이크로 RNA(miRNA)가 가장 많이 연구된 부류입니다. 이들 및 기타 순환 RNA는 세포 간 통신에 참여할 수 있고, 대조군과 비교하여 환자에서 차별적으로 발현될 수 있으며, 패혈증을 비롯한 다양한 급성 및 중환자 치료 적응증에서 질병 진행, 파종 또는 약물 반응과 연관될 수 있습니다. 신경 외상 및 심혈관 질환.

인간 혈장 또는 혈청의 최소 입력량에서 신뢰할 수 있고 완전한 순환 RNA 데이터를 얻기 위해 조건이 최적화되었습니다. 200 ul 혈청을 사용한 초기 연구는 ~15ng RNA를 산출했으며, 이는 차세대 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하기 위한 최소 입력 100pg를 분명히 초과했습니다. 3명의 건강한 인간 지원자 기증자의 파일럿 분석은 10M 판독/샘플을 초과하는 품질 기준을 통과했으며 평균 359개의 miRNA의 총 시그니처에서 98%의 엑소좀 miRNA가 검출되었음을 확인했습니다. 중요하게도, 이 방법은 임상 연구에 매우 적합한 샘플 볼륨에서 잠재적으로 유익한 순환 RNA의 전체 전사 환경에 대한 데이터를 생성합니다. 단일 인간 공여자의 혈청과 혈장을 모두 사용하는 추가 최적화 연구에서는 50µl의 작은 입력 부피에서도 우수한 품질의 RNA 데이터를 얻을 수 있으며 혈청과 혈장 모두에 대해 예상되는 RNA 생물형 분포가 발견되었음을 보여주었습니다.

목표

1) COVID-19 환자의 사이토카인 폭풍과 ARDS 사이의 연관성 2) 경증 및 중증 질환이 있는 COVID-19 환자의 바이오마커 프로필 3) COVID-19 환자의 임상 결과에 대한 유전적 변이의 영향

연구 계획

개요

COVID-19가 의심되어 Vancouver General Hospital(VGH) 또는 Surrey Memorial Hospital(SMH)의 집중 치료실(ICU) 및 중환자실(HAU)에 입원한 환자는 격리실에서 격리됩니다. 여기에서 SARS-CoV-2의 실험실 확인을 위해 표본을 수집합니다. 임상 치료가 시작되고 COVID-19 관리를 위한 VGH/VCH의 현재 운영 절차에 따라 주치의의 재량에 따라 안내됩니다.

임상 치료가 시작되면 ICU/HAU의 임상 직원이 ICU/HAU 입원 후 1-7일, 10일, 14일 및 21일에 혈액 샘플을 채취하여 vacutainer 혈청 분리기 튜브(SST, Vacutainer®, Becton & 디킨슨). 이 샘플은 사이토카인 패널, 염증 마커, CyTOF, RNA 및 유전자 검사를 위해 분석됩니다. 분석은 1)David Mowafaghian 뇌 건강 센터(UBC)의 Cheryl Wellington 박사 연구실, 2)Kelly McNagny 박사 연구실, DMCBH, UBC., 3)Dr. 세인트 폴 병원 심장폐 혁신 센터(Center for Heart Lung Innovation, HLI)의 Liam Brunham 연구실.

사이토카인 폭풍 증후군에 대한 일상적인 임상 치료의 일부로 투여되는 면역 조절 요법의 투여 후 인공호흡기 없는 날, PaO2/FiO2 및 염증성 사이토카인의 변화 변화를 조사하기 위해 내포된 일치 코호트 연구를 수행할 예정입니다.

통계 분석

이 질병 발생의 최근성으로 인해 강력한 통계 검정력 테스트가 어려워졌습니다. 그러나 COVID-1b, IL-2, IL-10 및 TNF-α를 기반으로 한 샘플 계산인 중환자 COVID 환자의 사이토카인 폭풍을 입증하는 여러 보고서 중 하나인 Huang과 동료의 최근 작업 데이터를 디지털화하여 데이터가 제공됩니다. 아래에 제시된 검정력 계산은 독립 샘플 비모수 Mann-Whitney-U 테스트에 대한 것이며 G*power(V3.1.9.1)에서 수행되었습니다.

IL-1: 이는 Huang과 동료들의 보고서에서 크게 다르지 않았습니다(Huang et al., 2020).

IL-2: Huang과 동료들로부터 도출된 추정 평균±표준편차는 IL-2의 9.5±4.3 및 6.7±4.3pg/mL로, 중환자 대 비중병 COVID-19 환자, 그룹당 ~40명의 환자(80 총) 차이를 감지하는 데 필요합니다(전력 = 0.80, 알파 = 0.05).

IL-6: 이것은 Huang과 동료들에 의해 측정되지 않았지만(Huang et al., 2020), 총 150명의 환자 샘플 크기로 Ruan과 동료들은 IL-6 수준의 상당한 차이를 감지할 수 있었습니다(Ruan et al. ., 2020).

IL-10: Huang 및 동료로부터 도출된 추정 평균±SD 19.5±39.6 및 5.3±4.3 중환자와 중증이 아닌 COVID-19 환자의 IL-10 pg/mL, 차이를 감지하려면 그룹당 약 60명의 환자(총 120명)가 필요합니다(파워 = 0.80, 알파 = 0.05).

TNF-α: Huang 및 동료로부터 도출된 추정 평균±SD 93.2±20.8 및 71.7±21.4 중환자와 중증이 아닌 COVID-19 환자의 TNF-α pg/mL, 차이를 감지하려면 그룹당 약 17명의 환자(총 34명)가 필요합니다(파워 = 0.80, 알파 = 0.05).

위에 제시된 샘플 크기 추정치를 감안할 때 Ruan과 동료들은 IL-6의 현저한 차이와 향후 몇 개월 동안 예상되는 COVID-19 환자의 입원률을 보고하여 최대 150명의 환자를 모집하는 것을 목표로 합니다.

log2 배 변화 >1 및 조정된 p 값 <0.05는 차별적으로 조절되는 RNA에 대한 유의성 임계값으로 사용됩니다. Ingenuity Pathway Analysis는 인과 관계 네트워크를 식별하는 데 사용되며, 추가 분석은 음수 로그 p 값 >20의 임계값으로 설정됩니다. 항균 반응, 염증 반응 및 전염병 필터를 사용하여 SARS-CoV-2 관련 RNA를 식별합니다. 히트 맵은 비교 분석을 통해 생성됩니다.

분석 계획

1차: ARDS가 발생한 환자와 그렇지 않은 환자 사이의 사이토카인 수준을 비교할 것입니다. 데이터의 독립 샘플 t-테스트는 정상(Shapiro Wilks 테스트를 통해 결정됨) 또는 데이터가 정규 분포가 아닌 경우 Mann-Whitney-U 테스트를 사용합니다.

선험적 분석: 생리학적 결과 및 혈청 바이오마커의 변화에 ​​대한 임상 치료의 일부로 제공된 면역억제제 또는 항바이러스제 투여의 효과를 평가할 것입니다.

2차: 2차 목표를 달성하기 위한 탐색적 분석에서 일일 사이토카인 측정을 활용하여 COVID-19 환자의 ARDS 발병과 관련된 사이토카인 역치가 있는지 확인합니다.

내포된 일치 코호트 연구:

1. 독립 샘플 양측 t-테스트를 ​​사용하여 토실리주맙(임상 치료의 일부로 투여)과 지지 그룹에서 인공호흡기 없는 날의 차이를 조사합니다.
2. 독립 샘플 양측 t-테스트를 ​​사용하여 토실리주맙(임상 치료의 일부로 투여) 및 지지 그룹에서 심폐 생리학적 결과(PaO2/FiO2, 평균 동맥압 및 심박수)의 차이를 조사합니다.
3. 독립 샘플 양측 t-테스트를 ​​사용하여 토실리주맙(임상 치료의 일부로 투여) 및 지지 그룹에서 혈청 염증성 사이토카인의 차이를 조사합니다.