Изучение роли биомаркеров в прогнозировании исхода COVID-19

ЦЕЛИ

1. Определить распространенность гипервоспалительного фенотипа «цитокинового шторма» COVID-19 у пациентов в Ванкуверской больнице общего профиля
2. Определить любые потенциальные связи между цитокиновым штормом и ОРДС у пациентов с COVID-19
3. Профилировать пациентов с легким и тяжелым заболеванием в попытке определить биомаркеры, которые могут быть использованы в экспресс-тесте для сортировки пациентов, которым требуется неотложная помощь, от тех, кто выздоровеет самостоятельно.
4. Выяснить влияние генетической изменчивости на клинические исходы от COVID-19
5. Идентифицировать релевантные РНК SARS-CoV-2
6. Определить различия в физиологических уровнях и уровнях цитокинов до и после лечения пациентов иммуномодулирующей терапией в рамках клинической помощи пациентам с COVID-19.

ГИПОТЕЗЫ

1. Первичный: исходя из предыдущих отчетов, примерно 50% пациентов с COVID-19 будут демонстрировать фенотип цитокинового шторма.
2. Вторичный: а) пациенты с цитокиновым штормом будут демонстрировать более высокую заболеваемость ОРДС б) мы определим биомаркеры для экспресс-тестирования в) вариации генов-хозяев повлияют на клинический исход инфекции COVID-19

ОБОСНОВАНИЕ

Новый человеческий коронавирус 2019 года, первоначально названный 2019-nCoV, а теперь именуемый коронавирусом-2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), возник в конце декабря 2019 года в Ухане, провинция Хубэй, Китай. Этот вирус вызывает заболевание, известное сейчас как COVID-19. После открытия SARS-CoV-2 был секвенирован его геном и определен рецептор входа в клетку. Его быстрое глобальное распространение и свидетельства передачи в сообществе указывают на вероятное продолжительное влияние на нашу систему здравоохранения и экономику. Это требует скоординированных действий медицинских работников и ученых для определения стратегий лечения и терапевтического лечения COVID-19.

Помимо усилий по разработке вакцин и противовирусных средств, внимание к новым терапевтическим вмешательствам было сравнительно минимальным, и на сегодняшний день имеется несколько отчетов о клинических испытаниях, которые вызвали призыв к действию по изучению методов лечения, направленных на хозяина, в дополнение к другим терапевтическим стратегиям. Недавно опубликованные клинические описания этого заболевания показали, что многие пациенты страдают как гипервоспалительным состоянием, называемым «цитокиновым штормом», с последующей смертью, часто связанной с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Однако, хотя цитокиновый шторм, по-видимому, связан с тяжестью заболевания, ключевые связи между наличием цитокинового шторма и развитием ОРДС, который в настоящее время является причиной наибольшей доли смертей от COVID-19, еще предстоит установить. Выявление такой связи и клиническое установление гипервоспалительного (т. цитокиновый шторм) обеспечит приоритет для специфического противовоспалительного лечения для снижения частоты ОРДС, связанного с COVID-19, и смертности, поскольку в настоящее время этот вопрос остается дискуссионным.

Анализы CyTOF: это инструмент протеомики отдельных клеток, который будет применяться с использованием специальной панели из 31 моноклонального антитела, разработанного нами для максимально широкого спектра клеток линии крови. McNagny разработал эту технологию в качестве платформы для NCE AllerGEN (заместитель научного директора этого NCE). Он идентифицирует с беспрецедентной точностью редкие подмножества зрелых клеток крови и клеток-предшественников. Он включает маркеры врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые играют важную роль в праймировании иммунных ответов, а также предшественники клеток крови костного мозга. Хроническое воспаление и тяжелое острое воспаление приводят к быстрому увеличению продукции воспалительных клеток и преждевременному высвобождению предшественников костного мозга. Панель прошла внутреннюю валидацию и показала свою полезность при выявлении взрослых пациентов с хроническими аллергическими заболеваниями, популяции, которая, по-видимому, в большей степени подвержена респираторным инфекциям. Будет поставлена ​​цель составить профиль пациентов с легким и тяжелым заболеванием, чтобы попытаться определить биомаркеры, которые можно было бы превратить в экспресс-тест для сортировки пациентов, которым требуется неотложная помощь, от тех, кто выздоровеет самостоятельно.

Генетическое тестирование. Авторы показали, что генетические различия хозяина оказывают значительное влияние на клинические исходы сепсиса. Например, мы показали, что вариант с одним нуклеотидом в гене СЕТР более чем удваивает риск 28-дневной смертности от сепсиса. Гипотеза состоит в том, что, как и в случае с другими формами критических заболеваний, вариации генов хозяина также будут влиять на клинический исход инфекции COVID-19. Эта работа предназначена для выяснения влияния генетической изменчивости на клинические исходы от COVID-19.

Тестирование РНК. Циркулирующие внеклеточные виды РНК обычно инкапсулированы во внеклеточные везикулы (ВВ), которые защищают их от деградации в жидкостях организма. Присутствует большое разнообразие биотипов циркулирующих РНК, при этом микроРНК (миРНК) являются наиболее изученным классом. Эти и другие циркулирующие РНК могут участвовать в межклеточной коммуникации, могут по-разному экспрессироваться у пациентов по сравнению с контрольной группой и могут быть связаны с прогрессированием заболевания, диссеминацией или реакцией на лекарственные средства при различных показаниях к неотложной помощи и интенсивной терапии, включая сепсис, нейротравмы и сердечно-сосудистые заболевания.

Условия оптимизированы для получения надежных и полных данных о циркулирующей РНК из минимальных вводимых объемов человеческой плазмы или сыворотки. Первоначальные исследования с использованием 200 мкл сыворотки дали примерно 15 нг РНК, что явно превышает минимальный ввод 100 пг для создания библиотек для секвенирования следующего поколения. Пилотный анализ 3 здоровых доноров-добровольцев прошел критерии качества, превышающие 10 млн считываний на образец, и подтвердил, что 98% экзосомальных миРНК были обнаружены в общем количестве сигнатур в среднем 359 миРНК. Важно отметить, что этот метод также дает данные обо всем ландшафте транскрипции потенциально информативных циркулирующих РНК из объемов образцов, очень подходящих для клинических исследований. Дальнейшие исследования по оптимизации с использованием как сыворотки, так и плазмы от одного донора-человека показали, что данные РНК хорошего качества могут быть получены уже от вводимого объема всего 50 мкл, и что ожидаемые распределения биотипов РНК были обнаружены как для сыворотки, так и для плазмы.

ЦЕЛИ

Лучше понять 1) связь между цитокиновым штормом и ОРДС у пациентов с COVID-19 2) профиль биомаркеров у пациентов с COVID-19 с легким и тяжелым течением заболевания 3) влияние генетической изменчивости на клинические исходы у пациентов с COVID-19

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

Обзор

Пациенты, поступившие в отделение интенсивной терапии (ICU) и отделение интенсивной терапии (HAU) Ванкуверской больницы общего профиля (VGH) или Мемориальной больницы Суррея (SMH) с подозрением на COVID-19, будут помещены на карантин в изолятор. Здесь будут собирать образцы для лабораторного подтверждения SARS-CoV-2. Клиническое лечение начнется по усмотрению лечащих врачей в соответствии с действующей процедурой VGH/VCH по лечению COVID-19.

После начала оказания клинической помощи образец крови будет взят на 1-7, 10, 14 и 21 дни после поступления в отделение интенсивной терапии / отделения интенсивной терапии медицинского персонала отделения интенсивной терапии / отделения интенсивной терапии в пробирки сепаратора сыворотки vacutainer (SST, Vacutainer®, Becton & Дикинсон). Эти образцы будут проанализированы на наличие панели цитокинов, воспалительных маркеров, CyTOF, РНК и генетического тестирования. Анализы будут проводиться в 1) лаборатории доктора Шерил Веллингтон в Центре здоровья мозга Дэвида Мовафагяна (UBC), 2) в лаборатории доктора Келли МакНэгни, DMCBH, UBC., 3) в лаборатории доктора. Лаборатория Лиама Брунхема в Центре инноваций сердечно-легочной системы (HLI) в больнице Святого Павла.

Будет проведено вложенное групповое исследование для изучения изменений в количестве дней без ИВЛ, PaO2/FiO2 и воспалительных цитокинов до и после введения иммуномодулирующей терапии, которая проводится в рамках рутинной клинической помощи при синдроме цитокинового шторма.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Недавняя вспышка этого заболевания затрудняет надежное тестирование статистической мощности. Однако, оцифровав данные из недавней работы Хуанга и его коллеги, которая является одним из нескольких отчетов, демонстрирующих цитокиновый шторм у тяжелобольных пациентов с COVID, расчет выборки основан на их IL-1b, IL-2, IL-10 и TNF-α. данные предоставляются. Представленные ниже расчеты мощности относятся к непараметрическому критерию Манна-Уитни-U для независимых выборок и были проведены в G*мощности (V3.1.9.1):

IL-1: в отчете Хуанга и его коллег это существенно не отличалось (Huang et al., 2020).

ИЛ-2: при расчетном среднем значении ± стандартное отклонение, полученном Хуангом и его коллегами и составляющем 9,5 ± 4,3 и 6,7 ± 4,3 пг/мл ИЛ-2 у пациентов с COVID-19 в критическом и некритическом состоянии, ~ 40 пациентов в группе (80 всего) потребуется для обнаружения разницы (мощность = 0,80, альфа = 0,05)

ИЛ-6: этот показатель не был измерен Хуангом и его коллегами (Huang et al., 2020), однако при размере выборки всего 150 пациентов Руан и его коллеги смогли обнаружить значительные различия в уровнях ИЛ-6 (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: расчетное среднее значение ± стандартное отклонение, полученное Huang и его коллегами, составляет 19,5 ± 39,6 и 5,3 ± 4,3. пг/мл ИЛ-10 у пациентов с COVID-19 в критическом и некритическом состоянии, для выявления разницы потребуется ~60 пациентов в группе (всего 120) (мощность = 0,80, альфа = 0,05).

TNF-α: расчетное среднее значение ± стандартное отклонение, полученное от Huang and Colleagues, составляет 93,2 ± 20,8 и 71,7 ± 21,4. пг/мл TNF-α у пациентов с COVID-19 в критическом и некритическом состоянии, для выявления разницы потребуется ~17 пациентов в группе (всего 34) (мощность = 0,80, альфа = 0,05)

Учитывая представленные выше оценки размера выборки, о заметной разнице в уровне IL-6, о которой также сообщили Руан и его коллеги, и ожидаемую частоту госпитализаций пациентов с COVID-19 в течение следующих нескольких месяцев, мы стремимся набрать до 150 пациентов.

Логарифмическое 2-кратное изменение > 1 и скорректированное значение р <0,05 будут использоваться в качестве порога значимости для дифференциально регулируемых РНК. Анализ пути изобретательности будет использоваться для выявления причинно-следственных сетей, а дальнейший анализ будет установлен на пороге отрицательного значения log p > 20. Мы будем использовать фильтры «Антимикробный ответ», «Воспалительный ответ» и «Инфекционные заболевания» для выявления РНК, имеющих отношение к SARS-CoV-2. Тепловые карты будут созданы путем сравнительного анализа.

План анализа

Первичный: мы сравним уровни цитокинов у пациентов, у которых развивается ОРДС, и у тех, у кого его нет. Мы будем использовать t-критерии независимых выборок, если данные являются нормальными (определены с помощью теста Шапиро-Уилкса), или критерий Манна-Уитни-U, если данные не распределены нормально.

Априорный анализ: мы будем оценивать эффекты иммунодепрессантов или противовирусных препаратов, назначаемых в рамках клинической помощи, исходя из физиологических исходов и изменений биомаркеров в сыворотке.

Вторичный: в исследовательском анализе, направленном на достижение нашей вторичной цели, мы будем использовать наши ежедневные измерения цитокинов, чтобы определить, существуют ли пороги цитокинов, которые связаны с развитием ОРДС у пациентов с COVID-19.

Вложенное согласованное когортное исследование:

1. Изучите различия в днях без ИВЛ в группах тоцилизумаба (вводимого как часть клинической помощи) и поддерживающих групп, используя двусторонний t-критерий независимых выборок.
2. Изучите различия в кардиореспираторных физиологических исходах (PaO2/FiO2, среднее артериальное давление и частота сердечных сокращений) в группах тоцилизумаба (вводимого как часть клинической помощи) и групп поддерживающей терапии с использованием двусторонних t-тестов для независимых выборок.
3. Изучите различия в сывороточных воспалительных цитокинах в группах тоцилизумаба (вводимого как часть клинической помощи) и поддерживающих групп, используя двусторонние t-тесты для независимых выборок.