Investigando o papel dos biomarcadores na previsão do resultado do COVID 19

FINS

1. Determinar a prevalência de um fenótipo de "tempestade de citocinas" hiperinflamatória COVID-19 em pacientes no Hospital Geral de Vancouver
2. Determine quaisquer ligações potenciais entre a tempestade de citocinas e a SDRA em pacientes com COVID-19
3. Perfilar pacientes com doença leve e grave na tentativa de identificar biomarcadores que possam ser desenvolvidos em um teste rápido para triagem de pacientes que requerem cuidados urgentes daqueles que se recuperarão por conta própria
4. Esclarecer o impacto da variação genética nos resultados clínicos do COVID-19
5. Identificar RNAs relevantes para SARS-CoV-2
6. Determinar as diferenças nos níveis fisiológicos e de citocinas antes e depois que os pacientes são tratados com terapias imunomoduladoras como parte do atendimento clínico em pacientes com COVID-19.

HIPÓTESES

1. Primário: com base em relatórios anteriores, aproximadamente 50% dos pacientes com COVID-19 demonstrarão um fenótipo de tempestade de citocinas
2. Secundário: a)Pacientes exibindo tempestade de citocinas demonstrarão uma maior incidência de SDRA b)Identificaremos biomarcadores para testes rápidos c)A variação do gene do hospedeiro influenciará o resultado clínico da infecção por COVID-19

JUSTIFICAÇÃO

O novo coronavírus humano de 2019, originalmente denominado 2019-nCoV, e agora conhecido como coronavírus-2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), teve origem em Wuhan, na província de Hubei, na China, no final de dezembro de 2019. Este vírus causa a doença agora conhecida como COVID-19. Após sua descoberta, o SARS-CoV-2 teve seu genoma sequenciado e o receptor de entrada celular determinado. Sua rápida disseminação global e evidências de transmissão comunitária indicam uma provável influência prolongada em nosso sistema de saúde e economia. Isso requer uma resposta coordenada dos profissionais de saúde e cientistas para discernir estratégias para o tratamento e gerenciamento terapêutico do COVID-19.

Fora dos esforços de desenvolvimento de vacinas e antivirais, o foco em novas intervenções terapêuticas tem sido comparativamente mínimo, com poucos relatórios de ensaios clínicos até o momento, o que provocou um apelo à ação para explorar terapias direcionadas ao hospedeiro, além de outras estratégias terapêuticas. Descrições clínicas recentemente publicadas desta doença indicaram que muitos pacientes sofrem de um estado hiperinflamatório, referido como uma "tempestade de citocinas" com morte subsequente, muitas vezes atribuível ao desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). No entanto, embora a tempestade de citocinas pareça estar associada à gravidade da doença, ainda não foram estabelecidas as principais ligações entre a presença da tempestade de citocinas e o desenvolvimento da SDRA, que atualmente é responsável pela maior proporção de mortes por COVID-19. Delineamento de tal ligação e estabelecimento clínico de um quadro hiperinflamatório (i.e. tempestade de citocinas) forneceria precedência para tratamentos anti-inflamatórios específicos para reduzir a incidência de SDRA associada à COVID-19 e a mortalidade, pois isso permanece em debate atualmente.

Análises CyTOF: é uma ferramenta proteômica de célula única que será aplicada usando um painel personalizado de 31 anticorpos monoclonais que desenvolvemos para a maior variedade possível de células de linhagem sanguínea. McNagny desenvolveu esta tecnologia como uma plataforma para o AllerGEN NCE (Diretor Científico Associado deste NCE). Ele identifica, em detalhes sem precedentes, subconjuntos raros de sangue maduro e células progenitoras. Inclui marcadores de células linfóides inatas (ILCs) que desempenham papéis potentes na ativação de respostas imunes e também progenitores de células sanguíneas da medula óssea. A inflamação crônica e a inflamação aguda grave levam a um rápido aumento da produção de células inflamatórias e à liberação prematura de progenitores da medula óssea. O painel foi validado internamente e mostrou utilidade na identificação de pacientes adultos com doença alérgica crônica, uma população que parece ser mais severamente afetada por infecções respiratórias. Haverá o objetivo de traçar o perfil de pacientes com doença leve e grave, na tentativa de identificar biomarcadores que possam ser desenvolvidos em um teste rápido para triagem de pacientes que necessitam de cuidados urgentes daqueles que se recuperarão por conta própria.

Teste genético: Os autores demonstraram que as diferenças genéticas do hospedeiro têm um impacto significativo nos resultados clínicos da sepse. Por exemplo, mostramos que uma única variante de nucleotídeo no gene CETP mais que dobra o risco de mortalidade em 28 dias por sepse. A hipótese é que, semelhante a outras formas de doença crítica, a variação do gene do hospedeiro também influenciará o resultado clínico da infecção por COVID-19. Este trabalho foi desenvolvido para elucidar o impacto da variação genética nos resultados clínicos do COVID-19.

Teste de RNA: Espécies de RNA livres de células circulantes são tipicamente encapsuladas em vesículas extracelulares (EVs) que as protegem da degradação nos fluidos corporais. Uma grande variedade de biótipos de RNA circulantes está presente, sendo os micro RNAs (miRNAs) a classe mais estudada. Esses e outros RNAs circulantes podem participar da comunicação célula a célula, podem ser expressos diferencialmente em pacientes em comparação com controles e podem estar associados à progressão da doença, disseminação ou respostas a medicamentos em uma variedade de indicações de cuidados agudos e intensivos, incluindo sepse, neurotrauma e doenças cardiovasculares.

As condições são otimizadas para obter dados confiáveis ​​e completos de RNA circulante a partir de volumes mínimos de entrada de plasma ou soro humano. Estudos iniciais usando 200 ul de soro renderam ~ 15 ng de RNA, claramente excedendo a entrada mínima de 100 pg para gerar bibliotecas para sequenciamento de próxima geração. A análise piloto de 3 doadores voluntários humanos saudáveis ​​passou nos critérios de qualidade excedendo 10 milhões de leituras/amostra e confirmou que 98% dos miRNAs exossomais foram detectados em assinaturas totais de uma média de 359 miRNAs. É importante ressaltar que este método também produz dados sobre toda a paisagem transcricional de RNAs circulantes potencialmente informativos de volumes de amostras muito viáveis ​​para estudos clínicos. Estudos de otimização adicionais usando soro e plasma de um único doador humano mostraram que dados de RNA de boa qualidade podem ser obtidos a partir de um volume de entrada de apenas 50 µl e que as distribuições esperadas de biótipos de RNA foram encontradas para soro e plasma

OBJETIVOS

Entenda melhor 1) as ligações entre a tempestade de citocinas e SDRA em pacientes com COVID-19 2) o perfil de biomarcadores de pacientes com COVID-19 com doença leve e grave 3) o impacto da variação genética nos resultados clínicos em pacientes com COVID-19

PROJETO DE PESQUISA

Visão geral

Os pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) e na Unidade de Alta Acuidade (HAU) no Vancouver General Hospital (VGH) ou no Surrey Memorial Hospital (SMH) com suspeita de COVID-19 serão colocados em quarentena em uma unidade de isolamento. Aqui, amostras serão coletadas para confirmação laboratorial do SARS-CoV-2. O atendimento clínico começará e será guiado pelo critério dos médicos assistentes, de acordo com o procedimento operacional atual do VGH/VCH para o gerenciamento do COVID-19.

Uma vez iniciado o atendimento clínico, uma amostra de sangue será coletada nos dias 1-7, 10, 14 e 21 após a admissão na UTI/HAU pela equipe clínica na UTI/HAU em tubos separadores de soro vacutainer (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Essas amostras serão analisadas para um painel de citocinas, marcadores inflamatórios, CyTOF, RNA e testes genéticos. As análises serão realizadas no 1) laboratório da Dra. Cheryl Wellington no David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) laboratório da Dra. Kelly McNagny, DMCBH, UBC., 3) Dr. Laboratório de Liam Brunham no Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

Um estudo de coorte pareado aninhado será conduzido para examinar as alterações nos dias sem ventilação, PaO2/FiO2 e citocinas inflamatórias antes da administração de terapias imunomoduladoras que são administradas como parte do atendimento clínico de rotina para a síndrome da tempestade de citocinas.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A recência deste surto de doença torna difícil o teste de poder estatístico robusto. No entanto, digitalizando dados do trabalho recente de Huang e colegas, que é um dos vários relatórios que demonstram a tempestade de citocinas em pacientes com COVID em estado crítico, um cálculo de amostra baseado em IL-1b, IL-2, IL-10 e TNF-α dados são fornecidos. Os cálculos de potência apresentados abaixo são para amostras independentes de teste Mann-Whitney-U não paramétrico e foram conduzidos em G*potência (V3.1.9.1):

IL-1: Isso não foi significativamente diferente no relatório de Huang e colegas (Huang et al., 2020).

IL-2: Com a média ± DP estimada derivada de Huang e colegas de 9,5 ± 4,3 e 6,7 ± 4,3 pg/mL de IL-2 em pacientes com COVID-19 em estado crítico versus não em estado crítico, ~ 40 pacientes por grupo (80 total) seria necessário para detectar uma diferença (potência = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: isso não foi medido por Huang e colegas (Huang et al., 2020), no entanto, com um tamanho de amostra de 150 pacientes no total, Ruan e colegas conseguiram detectar diferenças significativas nos níveis de IL-6 (Ruan et al ., 2020).

IL-10: Com a média ± DP estimada derivada de Huang e colegas de 19,5 ± 39,6 e 5,3 ± 4,3 pg/mL de IL-10 em pacientes com COVID-19 em estado crítico versus não grave, seriam necessários ~ 60 pacientes por grupo (120 no total) para detectar uma diferença (potência = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: Com a média ± DP estimada derivada de Huang e colegas de 93,2 ± 20,8 e 71,7 ± 21,4 pg/mL de TNF-α em pacientes com COVID-19 em estado crítico versus não em estado crítico, seriam necessários ~ 17 pacientes por grupo (34 no total) para detectar uma diferença (potência = 0,80, alfa = 0,05)

Dadas as estimativas de tamanho da amostra apresentadas acima, que uma diferença marcante na IL-6 também foi relatada por Ruan e colegas e a taxa de admissão antecipada de pacientes com COVID-19 nos próximos meses, pretendemos recrutar até 150 pacientes.

Uma mudança de log2 vezes > 1 e um valor de p ajustado de <0,05 serão usados ​​como o limite de significância para RNAs regulados diferencialmente. A Ingenuity Pathway Analysis será usada para identificar redes causais, com análises adicionais definidas em um limite de um valor p de log negativo >20. Usaremos os filtros Resposta Antimicrobiana, Resposta Inflamatória e Doenças Infecciosas para identificar RNAs relevantes para SARS-CoV-2. Mapas de calor serão gerados por análise de comparação.

Plano de Análise

Primário: Compararemos os níveis de citocinas entre pacientes que desenvolvem SDRA e aqueles que não. Usaremos testes t de amostras independentes nos dados são normais (determinados pelo teste Shapiro Wilks) ou testes Mann-Whitney-U se os dados não forem normalmente distribuídos.

Análise a priori: Avaliaremos os efeitos dos medicamentos imunossupressores ou antivirais administrados como parte do atendimento clínico sobre os resultados fisiológicos e as alterações nos biomarcadores séricos.

Secundário: Em análises exploratórias destinadas a cumprir nosso objetivo secundário, utilizaremos nossas medidas diárias de citocinas para determinar se existem limiares de citocinas associados ao desenvolvimento de SDRA em pacientes com COVID-19.

Estudo de coorte combinado aninhado:

1. Examine as diferenças nos dias livres do ventilador no tocilizumabe (administrado como parte do atendimento clínico) e nos grupos de suporte usando um teste t bicaudal de amostras independentes.
2. Examine as diferenças nos resultados fisiológicos cardiorrespiratórios (PaO2/FiO2, pressão arterial média e frequência cardíaca) no tocilizumabe (administrado como parte do tratamento clínico) e nos grupos de suporte usando testes t bicaudais de amostras independentes.
3. Examine as diferenças nas citocinas inflamatórias séricas no tocilizumabe (administrado como parte do tratamento clínico) e nos grupos de suporte usando testes t bicaudais de amostras independentes.