Investigación del papel de los biomarcadores en la predicción de resultados para COVID 19

FINALIDADES

1. Determinar la prevalencia de un fenotipo hiperinflamatorio de "tormenta de citoquinas" de COVID-19 en pacientes del Hospital General de Vancouver
2. Determinar cualquier vínculo potencial entre la tormenta de citocinas y el SDRA en pacientes con COVID-19
3. Perfilar a los pacientes con enfermedad leve y grave en un intento de identificar biomarcadores que podrían convertirse en una prueba rápida para clasificar a los pacientes que requieren atención urgente de aquellos que se recuperarán por sí solos.
4. Dilucidar el impacto de la variación genética en los resultados clínicos de COVID-19
5. Identificar los ARN relevantes del SARS-CoV-2
6. Determinar las diferencias en los niveles fisiológicos y de citoquinas antes y después de que los pacientes sean tratados con terapias inmunomoduladoras como parte de la atención clínica en pacientes con COVID-19.

HIPÓTESIS

1. Primario: según informes anteriores, aproximadamente el 50 % de los pacientes con COVID-19 demostrarán un fenotipo de tormenta de citoquinas
2. Secundario: a) Los pacientes que presenten una tormenta de citocinas demostrarán una mayor incidencia de ARDS b) Identificaremos biomarcadores para pruebas rápidas c) La variación del gen del huésped influirá en el resultado clínico de la infección por COVID-19

JUSTIFICACIÓN

El nuevo coronavirus humano de 2019, originalmente llamado 2019-nCoV, y ahora conocido como síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2), se originó en Wuhan, provincia de Hubei en China, a fines de diciembre de 2019. Este virus causa la enfermedad ahora conocida como COVID-19. Después de su descubrimiento, se ha secuenciado el genoma del SARS-CoV-2 y se ha determinado el receptor de entrada celular. Su rápida propagación global y la evidencia de transmisión comunitaria indican una probable influencia prolongada en nuestro sistema de salud y economía. Esto requiere una respuesta coordinada de los trabajadores de la salud y los científicos para discernir estrategias para el tratamiento y manejo terapéutico de COVID-19.

Fuera de los esfuerzos de desarrollo de vacunas y antivirales, el enfoque en intervenciones terapéuticas novedosas ha sido comparativamente mínimo, con pocos informes de ensayos clínicos hasta la fecha, lo que ha provocado un llamado a la acción para explorar terapias dirigidas al huésped además de otras estrategias terapéuticas. Las descripciones clínicas publicadas recientemente de esta enfermedad han indicado que muchos pacientes sufren un estado hiperinflamatorio, denominado "tormenta de citocinas", con la muerte subsiguiente a menudo atribuible al desarrollo del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Sin embargo, aunque la tormenta de citoquinas parece estar asociada con la gravedad de la enfermedad, aún no se han establecido vínculos clave entre la presencia de la tormenta de citoquinas y el desarrollo del SDRA, que actualmente es responsable de la mayor proporción de muertes por COVID-19. Delineación de dicho vínculo y establecimiento clínico de un hiperinflamatorio (es decir, tormenta de citocinas) daría prioridad a los tratamientos antiinflamatorios específicos para reducir la incidencia de ARDS asociado con COVID-19 y la mortalidad, ya que esto sigue siendo objeto de debate actualmente.

Análisis CyTOF: es una herramienta proteómica de una sola célula que se aplicará utilizando un panel personalizado de 31 anticuerpos monoclonales que desarrollamos para la gama más amplia posible de células de linaje sanguíneo. McNagny desarrolló esta tecnología como plataforma para AllerGEN NCE (Director Científico Asociado de este NCE). Identifica, con un detalle sin precedentes, subconjuntos raros de sangre madura y células progenitoras. Incluye marcadores de células linfoides innatas (ILC) que desempeñan un papel importante en la preparación de las respuestas inmunitarias y también en los progenitores de células sanguíneas de la médula ósea. Tanto la inflamación crónica como la inflamación aguda grave provocan un rápido aumento de la producción de células inflamatorias y la liberación prematura de progenitores de la médula ósea. El panel ha sido validado internamente y ha demostrado su utilidad en la identificación de pacientes adultos con enfermedades alérgicas crónicas, una población que parece verse más gravemente afectada por infecciones respiratorias. Habrá un objetivo para perfilar pacientes con enfermedad leve y grave en un intento de identificar biomarcadores que podrían convertirse en una prueba rápida para clasificar a los pacientes que requieren atención urgente de aquellos que se recuperarán por sí solos.

Pruebas genéticas: los autores han demostrado que las diferencias genéticas del huésped tienen un impacto significativo en los resultados clínicos de la sepsis. Por ejemplo, hemos demostrado que una variante de un solo nucleótido en el gen CETP duplica con creces el riesgo de mortalidad a los 28 días por sepsis. La hipótesis es que, de manera similar a otras formas de enfermedad crítica, la variación del gen del huésped también influirá en el resultado clínico de la infección por COVID-19. Este trabajo está diseñado para dilucidar el impacto de la variación genética en los resultados clínicos de COVID-19.

Pruebas de ARN: las especies de ARN libres de células circulantes generalmente se encapsulan en vesículas extracelulares (EV) que las protegen de la degradación en los fluidos corporales. Está presente una amplia variedad de biotipos de ARN circulante, siendo los micro ARN (miARN) la clase más estudiada. Estos y otros ARN circulantes pueden participar en la comunicación de célula a célula, pueden expresarse de manera diferente en pacientes en comparación con los controles y pueden estar asociados con la progresión de la enfermedad, la diseminación o las respuestas a los medicamentos en una variedad de indicaciones de cuidados agudos y críticos, incluida la sepsis, neurotraumatismos y enfermedades cardiovasculares.

Las condiciones se optimizan para obtener datos de ARN circulante fiables y completos a partir de volúmenes de entrada mínimos de plasma o suero humanos. Los estudios iniciales que utilizaron 200 ul de suero produjeron ~15 ng de ARN, superando claramente la entrada mínima de 100 pg para generar bibliotecas para la secuenciación de próxima generación. El análisis piloto de 3 donantes voluntarios humanos sanos superó los criterios de calidad que superaron los 10 millones de lecturas/muestra y confirmó que el 98 % de los miARN exosómicos se detectaron en firmas totales de un promedio de 359 miARN. Es importante destacar que este método también proporciona datos sobre todo el panorama transcripcional de ARN circulantes potencialmente informativos a partir de volúmenes de muestra muy factibles para estudios clínicos. Otros estudios de optimización que utilizaron suero y plasma de un solo donante humano demostraron que se podían obtener datos de ARN de buena calidad a partir de un volumen de entrada de tan solo 50 µl y que se encontraron las distribuciones de biotipo de ARN esperadas tanto para el suero como para el plasma.

OBJETIVOS

Comprender mejor 1) los vínculos entre la tormenta de citocinas y el SDRA en pacientes con COVID-19 2) el perfil de biomarcadores de pacientes con COVID-19 con enfermedad leve y grave 3) el impacto de la variación genética en los resultados clínicos en pacientes con COVID-19

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Descripción general

Los pacientes admitidos en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) y la Unidad de Cuidados Intensivos (HAU) en el Hospital General de Vancouver (VGH) o el Hospital Surrey Memorial (SMH) con sospecha de COVID-19 serán puestos en cuarentena en una unidad de aislamiento. Aquí, se recolectarán muestras para la confirmación de laboratorio de SARS-CoV-2. La atención clínica comenzará y se guiará por la discreción de los médicos tratantes de acuerdo con el procedimiento operativo actual de VGH/VCH para el manejo de COVID-19.

Una vez que haya comenzado la atención clínica, el personal clínico de la UCI/HAU recolectará una muestra de sangre los días 1 a 7, 10, 14 y 21 después de la admisión a la UCI/HAU en tubos con separador de suero vacutainer (SST, Vacutainer®, Becton y Dickinson). Estas muestras se analizarán para un panel de citocinas, marcadores inflamatorios, CyTOF, ARN y pruebas genéticas. Los análisis se realizarán en 1) el laboratorio de la Dra. Cheryl Wellington en el Centro David Mowafaghian para la Salud del Cerebro (UBC), 2) el laboratorio de la Dra. Kelly McNagny, DMCBH, UBC., 3) el Dr. Laboratorio de Liam Brunham en el Centro para la Innovación Heart Lung (HLI), Hospital St Paul.

Se llevará a cabo un estudio de cohorte emparejado anidado para examinar los cambios en los días sin ventilador, PaO2/FiO2 y citoquinas inflamatorias antes y después de la administración de terapias inmunomoduladoras que se administran como parte de la atención clínica de rutina para el síndrome de tormenta de citoquinas.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Lo reciente del brote de esta enfermedad dificulta las pruebas sólidas de poder estadístico. Sin embargo, al digitalizar los datos del trabajo reciente de Huang y su colega, que es uno de varios informes que demuestran la tormenta de citocinas en pacientes con COVID en estado crítico, un cálculo de muestra basado en su IL-1b, IL-2, IL-10 y TNF-α se proporcionan datos. Los cálculos de potencia que se presentan a continuación son para muestras independientes no paramétricas de la prueba Mann-Whitney-U y se realizaron en potencia G* (V3.1.9.1):

IL-1: Esto no fue significativamente diferente en el informe de Huang y colegas (Huang et al., 2020).

IL-2: con la media ± DE estimada derivada de Huang y colegas de 9,5 ± 4,3 y 6,7 ± 4,3 pg/mL de IL-2 en pacientes con COVID-19 en estado crítico versus no en estado crítico, ~40 pacientes por grupo (80 total) sería necesario para detectar una diferencia (potencia = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: esto no fue medido por Huang y sus colegas (Huang et al., 2020); sin embargo, con un tamaño de muestra de 150 pacientes en total, Ruan y sus colegas pudieron detectar diferencias significativas en los niveles de IL-6 (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: con la media ± DE estimada derivada de Huang y colegas de 19,5 ± 39,6 y 5,3 ± 4,3 pg/mL de IL-10 en pacientes con COVID-19 en estado crítico versus no en estado crítico, se necesitarían ~60 pacientes por grupo (120 en total) para detectar una diferencia (potencia = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: con la media ± DE estimada derivada de Huang y colegas de 93,2 ± 20,8 y 71,7 ± 21,4 pg/mL de TNF-α en pacientes con COVID-19 en estado crítico versus no en estado crítico, se necesitarían ~17 pacientes por grupo (34 en total) para detectar una diferencia (poder = 0,80, alfa = 0,05)

Dadas las estimaciones del tamaño de la muestra presentadas anteriormente, que Ruan y sus colegas también informaron una marcada diferencia en IL-6, y la tasa de admisión anticipada de pacientes con COVID-19 durante los próximos meses, nuestro objetivo es reclutar hasta 150 pacientes.

Se utilizará un cambio de veces log2 >1 y un valor de p ajustado de <0,05 como umbral de importancia para los ARN regulados diferencialmente. Se utilizará el análisis de ruta de ingenio para identificar las redes causales, y se establecerá un análisis adicional en un umbral de un valor de log p negativo >20. Usaremos los filtros de respuesta antimicrobiana, respuesta inflamatoria y enfermedades infecciosas para identificar los ARN relevantes del SARS-CoV-2. Los mapas de calor se generarán mediante análisis de comparación.

Plan de análisis

Primario: Compararemos los niveles de citoquinas entre pacientes que desarrollan SDRA y los que no. Usaremos pruebas t de muestras independientes en los datos normales (determinados a través de la prueba de Shapiro Wilks) o pruebas de Mann-Whitney-U si los datos no tienen una distribución normal.

Análisis a priori: evaluaremos los efectos de los medicamentos inmunosupresores o antivirales administrados como parte de la atención clínica, los resultados fisiológicos y los cambios en los biomarcadores séricos.

Secundario: en los análisis exploratorios destinados a cumplir con nuestro objetivo secundario, utilizaremos nuestras medidas diarias de citoquinas para determinar si hay umbrales de citoquinas asociados con el desarrollo de ARDS en pacientes con COVID-19.

Estudio de cohorte emparejado anidado:

1. Examine las diferencias en los días sin ventilador en los grupos de tocilizumab (administrado como parte de la atención clínica) y de apoyo mediante una prueba t de dos colas para muestras independientes.
2. Examine las diferencias en los resultados fisiológicos cardiorrespiratorios (PaO2/FiO2, presión arterial media y frecuencia cardíaca) en los grupos de tocilizumab (administrado como parte de la atención clínica) y de apoyo utilizando pruebas t de dos colas para muestras independientes.
3. Examine las diferencias en las citocinas inflamatorias séricas en los grupos de tocilizumab (administrado como parte de la atención clínica) y de apoyo mediante pruebas t de dos colas para muestras independientes.