Onderzoek naar de rol van biomarkers bij het voorspellen van de uitkomst van COVID 19

DOELEINDEN

1. Bepaal de prevalentie van een COVID-19 hyper-inflammatoir "cytokine storm" fenotype bij patiënten in het Vancouver General Hospital
2. Bepaal mogelijke verbanden tussen cytokinestorm en ARDS bij COVID-19-patiënten
3. Profiel van patiënten met milde en ernstige ziekte in een poging om biomarkers te identificeren die kunnen worden ontwikkeld tot een snelle test voor triage van patiënten die dringende zorg nodig hebben van patiënten die vanzelf zullen herstellen
4. Verhelder de impact van genetische variatie op klinische resultaten van COVID-19
5. Identificeer SARS-CoV-2 relevante RNA's
6. Om verschillen in fysiologische en cytokineniveaus te bepalen voor en nadat patiënten zijn behandeld met immunomodulerende therapieën als onderdeel van de klinische zorg bij COVID-19-patiënten.

HYPOTHESEN

1. Primair: op basis van eerdere rapporten zal ongeveer 50% van de COVID-19-patiënten een cytokine-stormfenotype vertonen
2. Secundair: a) Patiënten die een cytokinestorm vertonen, zullen een hogere incidentie van ARDS vertonen b) We zullen biomarkers identificeren voor snel testen c) Variatie in gastheergenen zal de klinische uitkomst van COVID-19-infectie beïnvloeden

RECHTVAARDIGING

Het nieuwe menselijke coronavirus uit 2019, oorspronkelijk 2019-nCoV genaamd, en nu aangeduid als het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus-2 (SARS-CoV-2), ontstond eind december 2019 in Wuhan in de provincie Hubei in China. Dit virus veroorzaakt de ziekte die nu bekend staat als COVID-19. Na de ontdekking van SARS-CoV-2 is sindsdien het genoom gesequenced en de celingangsreceptor bepaald. De snelle wereldwijde verspreiding en het bewijs van overdracht door de gemeenschap duiden op een waarschijnlijke langdurige invloed op ons gezondheidszorgsysteem en onze economie. Dit vereist een gecoördineerde reactie van gezondheidswerkers en wetenschappers om strategieën te onderscheiden voor de behandeling en het therapeutisch beheer van COVID-19.

Afgezien van de inspanningen voor de ontwikkeling van vaccins en antivirale middelen, is de focus op nieuwe therapeutische interventies relatief minimaal geweest, met tot nu toe weinig klinische onderzoeksrapporten, wat heeft geleid tot een oproep tot actie om naast andere therapeutische strategieën ook gastheergerichte therapieën te onderzoeken. Onlangs gepubliceerde klinische beschrijvingen van deze ziekte hebben aangetoond dat veel patiënten lijden aan zowel een hyper-inflammatoire toestand, aangeduid als een "cytokinestorm" met daaropvolgende dood vaak toe te schrijven aan de ontwikkeling van acute respiratory distress syndrome (ARDS). Hoewel cytokinestorm geassocieerd lijkt te zijn met de ernst van de ziekte, moeten de belangrijkste verbanden tussen de aanwezigheid van cytokinestorm en de ontwikkeling van ARDS, dat momenteel verantwoordelijk is voor het grootste deel van de COVID-19-sterfgevallen, nog worden vastgesteld. Afbakening van een dergelijk verband en klinische vaststelling van een hyperinflammatoire (d.w.z. cytokine storm) fenotype zou voorrang geven aan specifieke ontstekingsremmende behandelingen om de incidentie van COVID-19-geassocieerde ARDS en mortaliteit te verminderen, aangezien dit momenteel nog steeds ter discussie staat.

CyTOF-analyses: is een eencellige proteomische tool die zal worden toegepast met behulp van een aangepast panel van 31 monoklonale antilichamen die we hebben ontwikkeld op een zo breed mogelijke reeks bloedlijncellen. McNagny ontwikkelde deze technologie als platform voor de AllerGEN NVU (Associate Scientific Director van deze NVU). Het identificeert, in ongekend detail, zeldzame subsets van rijp bloed en voorlopercellen. Het omvat markers van aangeboren lymfoïde cellen (ILC's) die een krachtige rol spelen bij het op gang brengen van immuunresponsen en ook voorlopercellen van beenmergbloedcellen. Chronische ontsteking en ernstige acute ontsteking leiden beide tot een snelle toename van de productie van ontstekingscellen en voortijdige afgifte van beenmergvoorlopers. Het panel is intern gevalideerd en bruikbaar gebleken bij het identificeren van volwassen patiënten met chronische allergische aandoeningen, een populatie die ernstiger lijkt te worden getroffen door luchtweginfecties. Er zal een doel zijn om patiënten met milde en ernstige ziekte te profileren in een poging biomarkers te identificeren die kunnen worden ontwikkeld tot een snelle test voor triage van patiënten die dringende zorg nodig hebben van degenen die vanzelf zullen herstellen.

Genetische tests: auteurs hebben aangetoond dat genetische verschillen tussen de gastheer een significante invloed hebben op de klinische uitkomsten van sepsis. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat een enkele nucleotidevariant in het CETP-gen het risico op 28-dagen mortaliteit door sepsis meer dan verdubbelt. De hypothese is dat, net als bij andere vormen van kritieke ziekte, gastheergenvariatie ook de klinische uitkomst van een COVID-19-infectie zal beïnvloeden. Dit werk is bedoeld om de impact van genetische variatie op de klinische resultaten van COVID-19 op te helderen.

RNA-testen: Circulerende celvrije RNA-soorten zijn meestal ingekapseld in extracellulaire blaasjes (EV's) die ze beschermen tegen afbraak in lichaamsvloeistoffen. Er is een grote verscheidenheid aan circulerende RNA-biotypes aanwezig, waarbij micro-RNA's (miRNA's) de meest bestudeerde klasse zijn. Deze en andere circulerende RNA's kunnen deelnemen aan cel-tot-cel communicatie, kunnen differentieel tot expressie worden gebracht bij patiënten in vergelijking met controles, en kunnen worden geassocieerd met ziekteprogressie, verspreiding of geneesmiddelreacties bij een verscheidenheid aan acute en kritieke zorgindicaties, waaronder sepsis, neurotrauma en hart- en vaatziekten.

De omstandigheden zijn geoptimaliseerd om betrouwbare en volledige circulerende RNA-gegevens te verkrijgen uit minimale invoervolumes van menselijk plasma of serum. Eerste studies met 200 µl serum leverden ~15 ng RNA op, duidelijk meer dan de minimale input van 100 pg om bibliotheken te genereren voor sequencing van de volgende generatie. Pilotanalyse van 3 gezonde menselijke vrijwillige donoren voldeed aan kwaliteitscriteria van meer dan 10 miljoen reads/sample en bevestigde dat 98% van de exosomale miRNA's werd gedetecteerd in totale handtekeningen van gemiddeld 359 miRNA's. Belangrijk is dat deze methode ook gegevens oplevert over het gehele transcriptionele landschap van potentieel informatieve circulerende RNA's uit monstervolumes die zeer haalbaar zijn voor klinische studies. Verdere optimalisatiestudies met zowel serum als plasma van een enkele menselijke donor toonden aan dat RNA-gegevens van goede kwaliteit konden worden verkregen vanaf slechts 50 µl inputvolume en dat de verwachte RNA-biotypeverdelingen werden gevonden voor zowel serum als plasma

DOELSTELLINGEN

Beter begrijpen 1)de verbanden tussen cytokinestorm en ARDS bij COVID-19-patiënten 2)het biomarkerprofiel van COVID-19-patiënten met milde en ernstige ziekte 3)de impact van genetische variatie op klinische uitkomsten bij COVID-19-patiënten

ONDERZOEKSOPZET

Overzicht

Patiënten die zijn opgenomen op de Intensive Care Unit (ICU) en High Acuity Unit (HAU) in het Vancouver General Hospital (VGH) of Surrey Memorial Hospital (SMH) met vermoedelijke COVID-19, worden in quarantaine geplaatst in een isolatie-eenheid. Hier zullen monsters worden verzameld voor laboratoriumbevestiging van SARS-CoV-2. Klinische zorg zal beginnen en zal worden geleid door de discretie van behandelende artsen in overeenstemming met de huidige werkwijze van VGH/VCH voor het beheer van COVID-19.

Zodra de klinische zorg is begonnen, wordt op dag 1-7, 10, 14 en 21 na opname op de IC/HAU door klinisch personeel op de ICU/HAU een bloedmonster afgenomen in vacutainer-serumscheiderbuizen (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Deze monsters zullen worden geanalyseerd op een panel van cytokines, ontstekingsmarkers, CyTOF, RNA en genetische testen. De analyses zullen worden uitgevoerd in 1) het laboratorium van Dr. Cheryl Wellington in het David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) het laboratorium van Dr. Kelly McNagny, DMCBH, UBC., 3) Dr. Liam Brunham's lab in het Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

Er zal een genest gematcht cohortonderzoek worden uitgevoerd om de veranderingen in de veranderingen in beademingsvrije dagen, PaO2/FiO2 en inflammatoire cytokines te onderzoeken voor na toediening van immunomodulerende therapieën die worden toegediend als onderdeel van de routinematige klinische zorg voor het cytokinestormsyndroom.

STATISTISCHE ANALYSE

De recentheid van deze ziekte-uitbraak maakt het moeilijk om robuust statistisch vermogen te testen. Door gegevens van het recente werk van Huang en collega's te digitaliseren, een van de vele rapporten die cytokinestorm aantonen bij ernstig zieke COVID-patiënten, is een voorbeeldberekening gebaseerd op hun IL-1b, IL-2, IL-10 en TNF-α gegevens worden verstrekt. De hieronder gepresenteerde vermogensberekeningen zijn voor onafhankelijke steekproeven, niet-parametrische Mann-Whitney-U-test en werden uitgevoerd in G*power (V3.1.9.1):

IL-1: Dit was niet significant anders in het rapport van Huang en collega's (Huang et al., 2020).

IL-2: met het geschatte gemiddelde ± SD afgeleid van Huang en collega's van 9,5 ± 4,3 en 6,7 ± 4,3 pg/ml IL-2 bij ernstig zieke versus niet-kritiek zieke COVID-19-patiënten, ~ 40 patiënten per groep (80 totaal) nodig zou zijn om een ​​verschil te detecteren (power = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: dit werd niet gemeten door Huang en collega's (Huang et al., 2020), maar met een steekproefomvang van in totaal 150 patiënten konden Ruan en collega's significante verschillen in IL-6-niveaus detecteren (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: met het geschatte gemiddelde ± SD afgeleid van Huang en collega's van 19,5 ± 39,6 en 5,3 ± 4,3 pg/ml van IL-10 bij ernstig zieke versus niet-kritiek zieke COVID-19-patiënten, zouden ~60 patiënten per groep (120 in totaal) nodig zijn om een ​​verschil te detecteren (power = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: met het geschatte gemiddelde ± SD afgeleid van Huang en collega's van 93,2 ± 20,8 en 71,7 ± 21,4 pg/ml TNF-α bij ernstig zieke versus niet-kritiek zieke COVID-19-patiënten, ~17 patiënten per groep (34 in totaal) zouden nodig zijn om een ​​verschil te detecteren (power = 0,80, alfa = 0,05)

Gezien de hierboven gepresenteerde schattingen van de steekproefomvang, dat Ruan en collega's ook een duidelijk verschil in IL-6 meldden, en het verwachte aantal opnames van COVID-19-patiënten in de komende maanden, streven we ernaar om maximaal 150 patiënten te rekruteren.

Een log2-voudige verandering >1 en een aangepaste p-waarde van <0,05 zullen worden gebruikt als de significantiedrempel voor differentieel gereguleerde RNA's. Ingenuity Pathway Analysis zal worden gebruikt om causale netwerken te identificeren, waarbij verdere analyse wordt ingesteld op een drempelwaarde van een negatieve log p-waarde >20. We zullen de filters Antimicrobiële respons, Inflammatoire respons en Infectieziekte gebruiken om SARS-CoV-2-relevante RNA's te identificeren. Heatmaps worden gegenereerd door vergelijkingsanalyse.

Analyseplan

Primair: we zullen de niveaus van cytokines vergelijken tussen patiënten die ARDS ontwikkelen en degenen die dat niet doen. We zullen onafhankelijke steekproeven t-testen gebruiken in de gegevens is normaal (bepaald via de Shapiro Wilks-test), of Mann-Whitney-U-testen als de gegevens niet normaal verdeeld zijn.

A priori-analyse: we zullen de effecten beoordelen van immunosuppressieve of antivirale medicaties die worden gegeven als onderdeel van de klinische zorg voor fysiologische resultaten en de veranderingen in de serumbiomarkers.

Secundair: in verkennende analyses gericht op het bereiken van ons secundaire doel, zullen we onze dagelijkse cytokinemetingen gebruiken om te bepalen of er cytokinedrempels zijn die verband houden met de ontwikkeling van ARDS bij COVID-19-patiënten.

Geneste gematchte cohortstudie:

1. Onderzoek de verschillen in het aantal beademingsvrije dagen in de tocilizumab (toegediend als onderdeel van klinische zorg) en ondersteunende groepen met behulp van een tweezijdige t-test van onafhankelijke steekproeven.
2. Onderzoek de verschillen in de cardiorespiratoire fysiologische uitkomsten (PaO2/FiO2, gemiddelde arteriële druk en hartslag) in de tocilizumab (toegediend als onderdeel van klinische zorg) en ondersteunende groepen met behulp van tweezijdige t-testen van onafhankelijke steekproeven.
3. Onderzoek de verschillen in serum inflammatoire cytokines in de tocilizumab (toegediend als onderdeel van klinische zorg) en ondersteunende groepen met behulp van tweezijdige t-testen van onafhankelijke steekproeven.