Biomarkkerien roolin tutkiminen COVID 19:n tulosten ennustamisessa

TARKOITUKSET

1. Määritä COVID-19:n hyperinflammatorisen "sytokiinimyrskyn" fenotyypin esiintyvyys potilailla Vancouverin yleissairaalassa
2. Selvitä mahdolliset yhteydet sytokiinimyrskyn ja ARDS:n välillä COVID-19-potilailla
3. Profiloi potilaita, joilla on lievä ja vaikea sairaus yrittääksesi tunnistaa biomarkkereita, jotka voitaisiin kehittää pikatestiksi kiireellistä hoitoa tarvitsevien potilaiden tutkimiseksi potilaista, jotka toipuvat itsestään.
4. Selvitä geneettisen variaation vaikutus COVID-19:n kliinisiin tuloksiin
5. Tunnista SARS-CoV-2:n kannalta merkitykselliset RNA:t
6. Fysiologisten ja sytokiinitasojen erojen määrittäminen ennen ja jälkeen potilaiden hoidon immunomodulatorisilla hoidoilla osana COVID-19-potilaiden kliinistä hoitoa.

HYPOTEESIT

1. Ensisijainen: Aiempien raporttien perusteella noin 50 % COVID-19-potilaista osoittaa sytokiinimyrskyfenotyyppiä
2. Toissijainen: a) Potilailla, joilla on sytokiinimyrsky, esiintyy korkeampaa ARDS:n ilmaantuvuutta b) Tunnistamme biomarkkerit pikatestausta varten c) Isäntägeenin vaihtelu vaikuttaa COVID-19-infektion kliiniseen lopputulokseen

PERUSTELUT

Vuoden 2019 uusi ihmisen koronavirus, alunperin nimeltään 2019-nCoV ja jota nyt kutsutaan vakavaksi akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus-2 (SARS-CoV-2), sai alkunsa Wuhanista Hubein maakunnasta Kiinassa joulukuun 2019 lopulla. Tämä virus aiheuttaa taudin, joka tunnetaan nyt nimellä COVID-19. Löytämisensä jälkeen SARS-CoV-2:n genomi on sittemmin sekvensoitu ja soluunpääsyreseptori määritetty. Sen nopea maailmanlaajuinen leviäminen ja todisteet yhteisön leviämisestä viittaavat todennäköisesti pitkäaikaiseen vaikutukseen terveydenhuoltojärjestelmäämme ja talouteemme. Tämä edellyttää terveydenhuollon työntekijöiden ja tutkijoiden koordinoitua vastausta COVID-19:n hoito- ja terapeuttisen hallinnan strategioiden erottamiseen.

Rokotteiden ja virusten vastaisten kehitystoimien ulkopuolella keskittyminen uusiin terapeuttisiin interventioihin on ollut suhteellisen vähäistä, ja kliinisistä tutkimuksista on tähän mennessä raportoitu vain vähän, mikä on herättänyt kehotusta tutkia isäntäohjattuja hoitoja muiden terapeuttisten strategioiden lisäksi. Äskettäin julkaistut kliiniset kuvaukset tästä taudista ovat osoittaneet, että monet potilaat kärsivät sekä hyper-inflammatorisesta tilasta, jota kutsutaan "sytokiinimyrskyksi" ja myöhemmin kuolemaan, joka johtuu usein akuutin hengitysvaikeusoireyhtymän (ARDS) kehittymisestä. Vaikka sytokiinimyrsky näyttää liittyvän taudin vakavuuteen, keskeisiä yhteyksiä sytokiinimyrskyn esiintymisen ja tällä hetkellä suurimmasta osasta COVID-19-kuolemista aiheuttavan ARDS:n kehittymisen välillä ei ole vielä selvitetty. Sellaisen linkin rajaaminen ja hyperinflammatorisen (esim. sytokiinimyrsky) fenotyyppi antaisi etusijalle spesifiset tulehdusta ehkäisevät hoidot COVID-19:ään liittyvien ARDS:ien ja kuolleisuuden vähentämiseksi, koska tästä keskustellaan edelleen.

CyTOF-analyysit: on yksisoluinen proteominen työkalu, jota käytetään mukautetun 31 monoklonaalisen vasta-aineen paneelin avulla, jonka olemme kehittäneet mahdollisimman laajalle joukolle verisoluja. McNagny kehitti tämän teknologian alustaksi AllerGEN NCE:lle (tämän NCE:n apulaistieteellinen johtaja). Se tunnistaa ennennäkemättömän yksityiskohtaisesti harvinaiset kypsän veren ja esisolujen alajoukot. Se sisältää synnynnäisten lymfoidisolujen (ILC) markkereita, joilla on voimakas rooli immuunivasteiden käynnistämisessä, ja myös luuytimen verisolujen progenitorit. Krooninen tulehdus ja vakava akuutti tulehdus johtavat molemmat tulehdussolutuotannon nopeaan lisääntymiseen ja luuytimen esisolujen ennenaikaiseen vapautumiseen. Paneeli on sisäisesti validoitu, ja se on osoittautunut hyödylliseksi kroonista allergista sairautta sairastavien aikuisten potilaiden tunnistamisessa, populaatiossa, johon hengitystieinfektiot vaikuttavat vakavammin. Tavoitteena on profiloida potilaita, joilla on lievä ja vaikea sairaus, jotta voidaan tunnistaa biomarkkereita, joista voitaisiin kehittää pikatesti kiireellistä hoitoa tarvitsevien potilaiden tutkimiseksi niistä, jotka toipuvat itsestään.

Geneettinen testaus: Tekijät ovat osoittaneet, että isännän geneettisillä eroilla on merkittävä vaikutus sepsiksen kliinisiin tuloksiin. Olemme esimerkiksi osoittaneet, että yksi nukleotidivariantti CETP-geenissä yli kaksinkertaistaa 28 päivän sepsiskuolleisuuden riskin. Hypoteesi on, että muiden kriittisten sairauksien tapaan isäntägeenin vaihtelu vaikuttaa myös COVID-19-infektion kliiniseen lopputulokseen. Tämä työ on suunniteltu selvittämään geneettisen variaation vaikutusta COVID-19:n kliinisiin tuloksiin.

RNA-testaus: kiertävät soluttomat RNA-lajit on tyypillisesti kapseloitu solunulkoisiin rakkuloihin (EV:t), jotka suojaavat niitä hajoamiselta kehon nesteissä. Verenkierrossa on laaja valikoima RNA-biotyyppejä, joista mikro-RNA:t (miRNA:t) ovat tutkituin luokka. Nämä ja muut kiertävät RNA:t voivat osallistua solujen väliseen kommunikaatioon, niitä voidaan ilmentää eri tavalla potilaissa verrokkeihin verrattuna, ja ne voivat liittyä taudin etenemiseen, leviämiseen tai lääkevasteisiin useissa akuuteissa ja tehohoidon indikaatioissa, mukaan lukien sepsis, neurotraumat ja sydän- ja verisuonitaudit.

Olosuhteet optimoidaan luotettavan ja täydellisen verenkierron RNA-tietojen saamiseksi minimaalisista ihmisplasman tai seerumin syöttötilavuuksista. Ensimmäiset tutkimukset, joissa käytettiin 200 ul:aa seerumia, tuottivat ~15 ng RNA:ta, mikä ylitti selvästi 100 pg:n vähimmäissyötön seuraavan sukupolven sekvensointia varten. Pilottianalyysi 3 terveeltä vapaaehtoiselta ihmisluovuttajalta läpäisi laatukriteerit, jotka ylittivät 10 miljoonan lukeman/näyte ja vahvistivat, että 98 % eksosomaalisista miRNA:ista havaittiin keskimäärin 359 miRNA:n kokonaisallekirjoituksista. Tärkeää on, että tämä menetelmä tuottaa myös tietoa potentiaalisesti informatiivisten kiertävien RNA:iden koko transkriptiomaisemasta näytemääristä, jotka ovat erittäin mahdollisia kliinisissä tutkimuksissa. Lisäoptimointitutkimukset, joissa käytettiin sekä seerumia että plasmaa yhdeltä ihmisluovuttajalta, osoittivat, että hyvälaatuisia RNA-tietoja voitiin saada jo 50 µl:n syöttötilavuudesta ja että odotetut RNA-biotyyppijakaumat löydettiin sekä seerumille että plasmalle.

TAVOITTEET

Ymmärrä paremmin 1) sytokiinimyrskyn ja ARDS:n väliset yhteydet COVID-19-potilailla 2) lievää ja vaikeaa sairautta sairastavien COVID-19-potilaiden biomarkkeriprofiili 3) geneettisen variaation vaikutus kliinisiin tuloksiin COVID-19-potilailla

TUTKIMUS SUUNNITTELU

Yleiskatsaus

Potilaat, jotka on otettu Vancouverin yleissairaalan (VGH) tai Surrey Memorial Hospitalin (SMH) tehohoito-osastolle (ICU) ja High Acuity Unit (HAU) -epäilystä COVID-19-viruksesta, asetetaan karanteeniin eristysyksikössä. Täällä kerätään näytteitä SARS-CoV-2:n laboratoriovarmistusta varten. Kliininen hoito aloitetaan, ja sitä ohjaa hoitavien lääkäreiden harkintavalta VGH/VCH:n nykyisen COVID-19:n hallintaa koskevan toimintatavan mukaisesti.

Kun kliininen hoito on alkanut, verinäytteet otetaan päivinä 1-7, 10, 14 ja 21 ICU/HAU:n jälkeen ICU/HAU:n kliinisen henkilökunnan tultua vacutainer-seerumin erotinputkiin (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Näistä näytteistä analysoidaan sytokiinien, tulehdusmerkkiaineiden, CyTOF:n, RNA:n ja geneettisen testauksen paneeli. Analyysit suoritetaan 1) tohtori Cheryl Wellingtonin laboratoriossa David Mowafaghian Center for Brain Healthissa (UBC), 2) tohtori Kelly McNagnyn laboratoriossa, DMCBH, UBC., 3) Dr. Liam Brunhamin laboratorio Center for Heart Lung Innovationissa (HLI), St Paulin sairaalassa.

Suoritetaan sisäkkäinen sovitettu kohorttitutkimus, jossa tarkastellaan muutoksia hengityskonevapaiden päivien, PaO2/FiO2:n ja tulehduksellisten sytokiinien muutoksissa ennen sytokiinimyrskyoireyhtymän rutiininomaiseen kliiniseen hoitoon tarkoitettujen immunomoduloivien hoitojen antamista sen jälkeen.

TILASTOLLINEN ANALYYSI

Tämän taudinpurkauksen äskettäisyys tekee vankan tilastollisen tehotestauksen vaikeaksi. Kuitenkin digitoimalla tiedot Huangin ja kollegan viimeaikaisesta työstä, joka on yksi useista raporteista, jotka osoittavat sytokiinimyrskyn kriittisesti sairailla COVID-potilailla, näytelaskelma perustuu heidän IL-1b-, IL-2-, IL-10- ja TNF-α-arvoihinsa. tiedot tarjotaan. Alla esitetyt teholaskelmat ovat riippumattomille näytteille ei-parametrista Mann-Whitney-U-testiä ja ne suoritettiin G*teholla (V3.1.9.1):

IL-1: Tämä ei eronnut merkittävästi Huangin ja kollegoiden raportista (Huang et al., 2020).

IL-2: Huangin ja kollegoiden arvioidulla keskiarvolla ± SD 9,5 ± 4,3 ja 6,7 ​​± 4,3 pg/ml IL-2:ta kriittisesti sairailla vs. ei-kriittisesti sairailla COVID-19-potilailla, ~40 potilasta ryhmää kohden (80 yhteensä) tarvitaan eron havaitsemiseen (teho = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: Huang ja kollegat eivät mitanneet tätä (Huang et al., 2020), mutta yhteensä 150 potilaan otoskoolla Ruan ja kollegat pystyivät havaitsemaan merkittäviä eroja IL-6-tasoissa (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: Huangin ja kollegoiden arvioidulla keskiarvolla ± SD 19,5±39,6 ja 5,3±4,3 pg/ml IL-10:tä kriittisesti sairaissa ja ei-kriittisesti sairaissa COVID-19-potilaissa, ~60 potilasta ryhmää kohden (yhteensä 120) tarvittaisiin eron havaitsemiseen (teho = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: Huangin ja kollegoiden arvioidulla keskiarvolla ± SD 93,2±20,8 ja 71,7±21,4 pg/ml TNF-α:ta kriittisesti sairaissa ja ei-kriittisesti sairaissa COVID-19-potilaissa, ~17 potilasta ryhmää kohden (yhteensä 34) tarvittaisiin eron havaitsemiseen (teho = 0,80, alfa = 0,05)

Ottaen huomioon yllä esitetyt otoskokoarviot, että myös Ruan ja kollegat ilmoittivat merkittävästä erosta IL-6:ssa, sekä COVID-19-potilaiden odotetun vastaanoton määrän seuraavien kuukausien aikana, pyrimme rekrytoimaan jopa 150 potilasta.

Log2-kertaista muutosta > 1 ja säädettyä p-arvoa <0,05 käytetään merkitsevyyskynnyksenä differentiaalisesti säädellyille RNA:ille. Ingenuity Pathway Analysis -analyysiä käytetään syy-verkostojen tunnistamiseen, ja lisäanalyysi asetetaan negatiivisen log p-arvon kynnykseen >20. Käytämme antimikrobiaalisen vasteen, tulehdusvasteen ja tartuntatautisuodattimia SARS-CoV-2:n merkityksellisten RNA:iden tunnistamiseen. Lämpökartat luodaan vertailuanalyysillä.

Analyysisuunnitelma

Ensisijainen: Vertaamme sytokiinien tasoja potilaiden välillä, joille kehittyy ARDS, ja niiden potilaiden välillä, joilla ei ole. Käytämme riippumattomien näytteiden t-testejä tiedoissa on normaali (määritetty Shapiro Wilks -testillä) tai Mann-Whitney-U -testejä, jos data ei ole normaalijakautunut.

A priori -analyysi: Arvioimme osana kliinistä hoitoa annettujen immunosuppressanttien tai viruslääkkeiden vaikutuksia fysiologisiin tuloksiin ja seerumin biomarkkereiden muutoksiin.

Toissijainen: Toissijaisen tavoitteemme saavuttamiseen tähtäävissä tutkivissa analyyseissä käytämme päivittäisiä sytokiinimittauksiamme määrittääksemme, onko olemassa sytokiinikynnyksiä, jotka liittyvät ARDS:n kehittymiseen COVID-19-potilailla.

Sisäkkäinen vastaava kohorttitutkimus:

1. Tutki erot hengityskonevapaiden päivien välillä kliinisen hoidon osana annetussa tosilitsumabissa ja tukiryhmissä käyttämällä riippumattomien näytteiden kaksisuuntaista t-testiä.
2. Tutki eroja sydän- ja hengityselimistön fysiologisissa tuloksissa (PaO2/FiO2, keskimääräinen valtimopaine ja syke) tosilitsumabilla (annettiin osana kliinistä hoitoa) ja tukiryhmissä käyttämällä riippumattomia näytteitä kaksisuuntaisia ​​t-testejä.
3. Tutki eroja seerumin tulehduksellisten sytokiinien välillä tosilitsumabissa (annettiin osana kliinistä hoitoa) ja tukiryhmissä käyttämällä riippumattomia näytteitä kaksisuuntaisia ​​t-testejä.