Undersøgelse af biomarkørers rolle i at forudsige udfald for COVID 19

FORMÅL

1. Bestem prævalensen af ​​en COVID-19 hyperinflammatorisk "cytokin storm" fænotype hos patienter på Vancouver General Hospital
2. Bestem eventuelle potentielle forbindelser mellem cytokinstorm og ARDS hos COVID-19-patienter
3. Profil patienter med mild og svær sygdom i et forsøg på at identificere biomarkører, der kunne udvikles til en hurtig test til triaging af patienter, som kræver akut behandling fra dem, der vil komme sig af sig selv
4. Belyse virkningen af ​​genetisk variation på kliniske resultater fra COVID-19
5. Identificer SARS-CoV-2 relevante RNA'er
6. At bestemme forskelle i fysiologiske og cytokinniveauer før og efter, at patienter behandles med immunmodulerende terapier som en del af den kliniske pleje hos COVID-19-patienter.

HYPOTESER

1. Primær: Baseret på tidligere rapporter vil cirka 50 % af COVID-19-patienter demonstrere en cytokinstormfænotype
2. Sekundært: a)Patienter, der udviser cytokinstorm, vil vise en højere forekomst af ARDS b)Vi vil identificere biomarkører til hurtig test c)Værtsgenvariation vil påvirke det kliniske resultat af COVID-19-infektion

BEGRUNDELSE

Den nye humane coronavirus fra 2019, oprindeligt navngivet 2019-nCoV, og nu omtalt som det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus-2 (SARS-CoV-2), opstod i Wuhan i Hubei-provinsen i Kina sidst i december 2019. Denne virus forårsager sygdommen nu kendt som COVID-19. Efter sin opdagelse har SARS-CoV-2 siden fået sit genom sekventeret og celleindgangsreceptor bestemt. Dens hurtige globale udbredelse og beviser for samfundsoverførsel indikerer en sandsynlig langvarig indflydelse på vores sundhedssystem og økonomi. Dette nødvendiggør en koordineret reaktion fra sundhedspersonale og videnskabsmænd for at skelne strategier for behandling og terapeutisk håndtering af COVID-19.

Uden for vaccine- og antivirale udviklingsindsatser har fokus på nye terapeutiske interventioner været relativt minimalt med få kliniske forsøgsrapporter til dato, hvilket har fremkaldt en opfordring til handling for at udforske værtsrettede terapier ud over andre terapeutiske strategier. Nyligt offentliggjorte kliniske beskrivelser af denne sygdom har indikeret, at mange patienter lider af både en hyperinflammatorisk tilstand, omtalt som en "cytokinstorm" med efterfølgende død, der ofte kan tilskrives udviklingen af ​​akut respiratorisk distress syndrom (ARDS). Men mens cytokinstorm ser ud til at være forbundet med sygdommens sværhedsgrad, er nøgleforbindelser mellem tilstedeværelsen af ​​cytokinstorm og udviklingen af ​​ARDS, som i øjeblikket er ansvarlig for den største andel af COVID-19-dødsfald, endnu ikke etableret. Afgrænsning af en sådan forbindelse og klinisk etablering af en hyperinflammatorisk (dvs. cytokinstorm) fænotype ville give forrang for specifikke antiinflammatoriske behandlinger for at reducere forekomsten af ​​COVID-19-associeret ARDS og dødelighed, da dette fortsat diskuteres i øjeblikket.

CyTOF-analyser: er et enkeltcelle-proteomisk værktøj, der vil blive anvendt ved hjælp af et brugerdefineret panel af 31 monoklonale antistoffer, vi udviklede til det bredest mulige udvalg af blodceller. McNagny udviklede denne teknologi som en platform for AllerGEN NCE (associeret videnskabelig direktør for denne NCE). Den identificerer i hidtil uset detalje sjældne undergrupper af modne blod- og stamceller. Det inkluderer markører for medfødte lymfoide celler (ILC'er), der spiller potente roller i priming af immunresponser, og også knoglemarvsblodcelleprogenitorer. Kronisk inflammation og alvorlig akut inflammation fører begge til en hurtig stigning i inflammatorisk celleproduktion og for tidlig frigivelse af knoglemarvsstamceller. Panelet er blevet internt valideret og vist anvendelighed til at identificere voksne patienter med kronisk allergisk sygdom, en befolkning, der ser ud til at være mere alvorligt påvirket af luftvejsinfektioner. Der vil være et mål at profilere patienter med mild og svær sygdom i et forsøg på at identificere biomarkører, der kan udvikles til en hurtig test til triaging af patienter, som kræver akut behandling fra dem, der vil komme sig af sig selv.

Genetisk test: Forfattere har vist, at værtsgenetiske forskelle har en betydelig indvirkning på de kliniske resultater af sepsis. For eksempel har vi vist, at en enkelt nukleotidvariant i CETP-genet mere end fordobler risikoen for 28-dages dødelighed fra sepsis. Hypotesen er, at i lighed med andre former for kritisk sygdom, vil værtsgenvariation også påvirke det kliniske resultat af COVID-19-infektion. Dette arbejde er designet til at belyse virkningen af ​​genetisk variation på kliniske resultater fra COVID-19.

RNA-test: Cirkulerende cellefri RNA-arter er typisk indkapslet i ekstracellulære vesikler (EV'er), der beskytter dem mod nedbrydning i kropsvæsker. En bred vifte af cirkulerende RNA-biotyper er til stede, hvor mikro-RNA'er (miRNA'er) er den mest undersøgte klasse. Disse og andre cirkulerende RNA'er kan deltage i celle-til-celle-kommunikation, kan udtrykkes differentielt i patienter sammenlignet med kontroller og kan være forbundet med sygdomsprogression, formidling eller lægemiddelreaktioner i en række akutte og kritiske behandlingsindikationer, herunder sepsis, neurotraumer og hjerte-kar-sygdomme.

Betingelserne er optimeret til at opnå pålidelige og fuldstændige cirkulerende RNA-data fra minimale inputvolumener af humant plasma eller serum. Indledende undersøgelser med 200 ul serum gav ~15ng RNA, hvilket klart oversteg den minimale input på 100pg for at generere biblioteker til næste generations sekventering. Pilotanalyse fra 3 raske humane frivillige donorer bestod kvalitetskriterier, der oversteg 10M aflæsninger/prøve og bekræftede, at 98% af exosomale miRNA'er blev påvist i samlede signaturer af et gennemsnit på 359 miRNA'er. Det er vigtigt, at denne metode også giver data om hele det transkriptionelle landskab af potentielt informative cirkulerende RNA'er fra prøvevolumener, der er meget gennemførlige for kliniske undersøgelser. Yderligere optimeringsundersøgelser med både serum og plasma fra en enkelt menneskelig donor viste, at RNA-data af god kvalitet kunne opnås fra så lidt som 50 µl inputvolumen, og at de forventede RNA-biotypefordelinger blev fundet for både serum og plasma

MÅL

Bedre forståelse af 1) sammenhængen mellem cytokinstorm og ARDS hos COVID-19-patienter 2) biomarkørprofilen for COVID-19-patienter med mild og svær sygdom 3) indvirkningen af ​​genetisk variation på kliniske resultater hos COVID-19-patienter

FORSKNINGSDESIGN

Oversigt

Patienter indlagt på Intensive Care Unit (ICU) og High Acuity Unit (HAU) på Vancouver General Hospital (VGH) eller Surrey Memorial Hospital (SMH) med mistanke om COVID-19 vil blive sat i karantæne i en isolationsenhed. Her vil der blive indsamlet prøver til laboratoriebekræftelse af SARS-CoV-2. Klinisk behandling vil påbegyndes og være styret af behandlende lægers skøn i overensstemmelse med VGH/VCHs nuværende driftsprocedure for håndtering af COVID-19.

Når den kliniske behandling er påbegyndt, vil der blive udtaget en blodprøve på dag 1-7, 10, 14 og 21 efter ICU/HAU indlæggelse af klinisk personale på ICU/HAU i vacutainer serumseparatorrør (SST, Vacutainer®, Becton & Dickinson). Disse prøver vil blive analyseret for et panel af cytokiner, inflammatoriske markører, CyTOF, RNA og genetisk testning. Analyser vil blive udført på 1)Dr. Cheryl Wellingtons laboratorium på David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2)Dr. Kelly McNagnys laboratorium, DMCBH, UBC., 3)Dr. Liam Brunhams laboratorium på Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

Et indlejret matchet kohortestudie vil blive udført for at undersøge ændringerne i ændringerne i ventilatorfrie dage, PaO2/FiO2 og inflammatoriske cytokiner før efter administration af immunmodulerende terapier, som er administration som en del af rutinemæssig klinisk behandling af cytokinstormsyndrom.

STATISTISK ANALYSE

Den nylige udbrud af dette sygdomsudbrud gør robust statistisk effekttestning vanskelig. Men ved at digitalisere data fra Huang og kollegas nylige arbejde, som er en af ​​flere rapporter, der demonstrerer cytokinstorm hos kritisk syge COVID-patienter, er en prøveberegning baseret på deres IL-1b, IL-2, IL-10 og TNF-α data leveres. De nedenfor præsenterede effektberegninger er for uafhængige prøver, ikke-parametrisk Mann-Whitney-U-test og blev udført i G*power (V3.1.9.1):

IL-1: Dette var ikke signifikant anderledes i rapporten fra Huang og kolleger (Huang et al., 2020).

IL-2: Med det estimerede middel±SD afledt fra Huang og kolleger på 9,5±4,3 og 6,7±4,3 pg/mL IL-2 hos kritisk syge versus ikke-kritisk syge COVID-19-patienter, ~40 patienter pr. gruppe (80 total) ville være nødvendig for at detektere en forskel (effekt = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: Dette blev ikke målt af Huang og kolleger (Huang et al., 2020), men med en stikprøvestørrelse på i alt 150 patienter var Ruan og kolleger i stand til at påvise signifikante forskelle i IL-6-niveauer (Ruan et al. ., 2020).

IL-10: Med den estimerede middelværdi±SD afledt af Huang og kolleger på 19,5±39,6 og 5,3±4,3 pg/ml af IL-10 hos kritisk syge versus ikke-kritisk syge COVID-19-patienter, ville ~60 patienter pr. gruppe (120 i alt) være nødvendige for at påvise en forskel (styrke = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: Med den estimerede middelværdi±SD afledt af Huang og kolleger på 93,2±20,8 og 71,7±21,4 pg/ml TNF-α hos kritisk syge versus ikke-kritisk syge COVID-19 patienter, ~17 patienter pr. gruppe (34 i alt) ville være nødvendige for at påvise en forskel (styrke = 0,80, alfa = 0,05)

I betragtning af de ovenfor præsenterede stikprøvestørrelsesestimater, at en markant forskel i IL-6 også blev rapporteret af Ruan og kolleger, og den forventede indlæggelsesrate for COVID-19-patienter i løbet af de næste mange måneder, sigter vi mod at rekruttere op til 150 patienter.

En log2-fold ændring >1 og en justeret p-værdi på <0,05 vil blive brugt som tærsklen for signifikans for differentielt regulerede RNA'er. Opfindsomhed Pathway Analysis vil blive brugt til at identificere kausale netværk, med yderligere analyse sat til en tærskel på en negativ log p-værdi >20. Vi vil bruge filtrene for antimikrobiel respons, inflammatorisk respons og infektionssygdomme til at identificere SARS-CoV-2-relevante RNA'er. Varmekort vil blive genereret ved sammenligningsanalyse.

Analyseplan

Primær: Vi vil sammenligne niveauerne af cytokiner mellem patienter, der udvikler ARDS, og dem, der ikke gør. Vi vil bruge uafhængige samples t-tests i dataene er normale (bestemt via Shapiro Wilks test), eller Mann-Whitney-U tests, hvis dataene ikke er normalfordelt.

A priori-analyse: Vi vil vurdere virkningerne af immunsuppressive eller antivirale midler givet som en del af klinisk pleje ud af fysiologiske resultater og ændringerne i serumbiomarkørerne.

Sekundært: I eksplorative analyser, der har til formål at opfylde vores sekundære mål, vil vi bruge vores daglige cytokinmålinger til at afgøre, om der er cytokintærskler, der er forbundet med udviklingen af ​​ARDS hos COVID-19-patienter.

Indlejret matchet kohorteundersøgelse:

1. Undersøg forskellene i de respiratorfrie dage i tocilizumab (indgivet som en del af den kliniske pleje) og støttende grupper ved hjælp af en uafhængig to-halet t-test.
2. Undersøg forskellene i de kardiorespiratoriske fysiologiske resultater (PaO2/FiO2, gennemsnitligt arterielt tryk og hjertefrekvens) i tocilizumab (indgivet som en del af klinisk behandling) og støttende grupper ved hjælp af uafhængige prøver med to-halede t-tests.
3. Undersøg forskellene i serum inflammatoriske cytokiner i tocilizumab (indgivet som en del af klinisk pleje) og støttende grupper ved hjælp af uafhængige prøver med to-halede t-tests.