ブラジル人患者とその近親者における心臓チャネル病の遺伝子解析

遺伝性不整脈は、さまざまな表現力と不完全な浸透率によって特徴付けられます。 これらの疾患の遺伝的基盤を解明するには、広範な遺伝子型 - 表現型研究が必要です。 チャネロパシーの分子遺伝学を研究する理由はいくつかあります。たとえば、これらの疾患の分子疫学を決定すること、疾患の分子基盤をよりよく理解するための証拠を提供すること、発生の遺伝的パターンを決定すること (継承または再発)、および診断と遺伝カウンセリング。 さらに、これらの疾患の遺伝子研究は、これらの疾患に関連する新しい遺伝子バリアントの発見や実験モデルの作成につながる可能性があります。

QT延長症候群、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍、ブルガダ症候群、およびQT短縮症候群を含む、遺伝的に遺伝したチャネル病が臨床的に強く疑われる患者には、遺伝子検査が推奨される（クラスI）。 初発例で特定された変異に対する特定の遺伝子検査も、家族に対して推奨される（クラス I）。

心臓チャネル病の分子遺伝学は、先進国の集団で広く研究されています。 これまで、最も頻繁に使用されていた方法は、単一または少数の疑わしい遺伝子の配列決定でした。 最近では、より広いパネルまたは完全なエクソームのシーケンシングさえもますます使用されています。 この手順により、ますます多くの遺伝子変異が発見されるようになりました。

これらの病気の多くの症例の遺伝的根拠は知られていますが、多くの家族はまだ明確な遺伝的原因を持っていません. その上、個々の変異の病原性と臨床的進化を予測することは困難です。 人工多能性幹細胞 (iPS) の生成における最近の進歩により、不整脈のトランスレーショナル研究が大幅に進歩する可能性があります。

1995 年の最初のチャネロパシーの発見以来、診断および予後目的での遺伝子検査の使用は大幅に進化し、現在では研究目的だけでなく臨床現場でも使用されています。 これらすべての進歩にもかかわらず、一部の疾患の有無を決定するために DNA 配列決定を使用することは困難です。なぜなら、これらすべての臨床症候群はさまざまな変異に関連している可能性があり、その多くはまだ説明されていないからです。 遺伝性不整脈患者の遺伝子配列決定は、十分に特徴付けられた変異に関連する臨床情報を提供するだけでなく、新しい遺伝子変化の発見に貢献するためにも不可欠です。 たとえば、ブルガダ症候群では、これまでに 12 の遺伝子型が報告されていますが、遺伝的変化は 30% の症例でしか確認されていません。 これらの不一致の理由は、機能と心臓イオン チャネルの調節に関与するすべての経路のまだ不完全な知識に関連しています。

最も研究されているチャネロパシーの簡単な説明を以下に示します。 QT 延長症候群 (LQTS) この疾患は、世界のさまざまな地域のさまざまな民族グループで確認されています。 これまでに少なくとも 13 の病型が報告されていますが、約 20% の症例の原因はまだ特定されていません。

この疾患は、QT 間隔の延長と不整脈イベントによって特徴付けられます。 これらの患者に通常見られる不整脈は、多形性心室頻拍 (torsades de pointes) のエピソードであり、めまいと失神を引き起こし、心室細動と突然死に進行する可能性があります。 LQTS の影響を受けた個人は、一般集団よりも心房細動にかかりやすい これは最も研究されているチャネロパシーであり、遺伝的変異と臨床的進化の間の相関は非常に高い. 現在、LQT1 患者では運動や精神的ストレスが不整脈の引き金となり、LQT3 患者では通常、睡眠中に不整脈が起こることが知られています。 LQT8 は非常に攻撃的で、症状が早期に現れ、治療に対する反応が悪いことも知られています。 遺伝的に証明された LQTS 症例の少なくとも 20% は、正常な ECG を持っています。 これらすべての理由から、LQTS は、遺伝的特徴付けが臨床状態の病態生理学を理解し、治療を改善するのにどのように役立つかを示す例です。

ブルガダ症候群 (BRS) この臨床症候群は、心室細動に変性する可能性のある多形性心室頻拍の自発的エピソードと、V1 から V3 への ST セグメントの上昇の典型的な心電図パターンを特徴としています。

この病気の有病率はアジアで高く、一部の地域では、50 歳未満の男性の自然死の最も一般的な原因と考えられています。

この症候群は通常成人期に始まり、小児ではまれです。 いくつかの遺伝子型がすでに記載されており、典型的にはナトリウム (Na) の流れの減少またはカリウム (K) の流れの増加を伴います。 遺伝のパターンは常染色体優性なので、家族の半数が罹患すると予想されます。 LQTS について前述したように、ブルガダ症候群の臨床基準を持ついくつかの症例の分子遺伝学はまだ解明されていません。

最適な治療法は、除細動器の埋め込みです。 雷雨の場合にはイソプロテレノールまたはキニジンを使用できますが、薬理学的治療は安全ではありません。 これらの患者の一部を制御するためにアブレーションが調査されています。

診断は、疾患の臨床的証拠に関連する典型的なパターンを持つ心電図 (ECG) から行われます。 典型的なパターンは一過性である可能性があるため、場合によっては刺激的な薬物検査が必要になる場合があります。 アジマリンなどの Na チャネルの遮断薬は、これらの患者の特定に役立ちます。

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) この疾患は、アドレナリン刺激によって引き起こされる双方向性または多形性心室頻拍の不整脈イベントを特徴とします。 ベースラインの心電図および画像検査は非特異的です。 心室性不整脈は努力中にのみ観察されるため、ストレステストとホルターは重要な診断方法です。 これまでに2種類の変異が報告されています。 1 つはリアノジン受容体にあり、もう 1 つはカルセクエストリンをコードする遺伝子にあります。 診断された個人の 60% だけがこれらの変異の 1 つを保有しているため、他の遺伝子が関与している必要があります。 その他の状態 QT 短縮症候群、原因不明突然死症候群、特発性心室細動、早期再分極、心房細動のいくつかの遺伝的形態など、いくつかの他の不整脈遺伝性症候群が報告されています。 多くの患者は、中絶突然死のエピソードの後に​​診断されます。 これらの症例のより良い遺伝的分類は、これらの疾患に関与するメカニズムをよりよく理解し、治療を改善するのに役立つ可能性があります. 家族のスクリーニングと適切な遺伝カウンセリングが不可欠です。

目的 主な目的 この研究は、ブラジルの患者とその家族の心臓チャネル病の包括的な遺伝子解析を行うことを目的としています。

副次的な目的 不整脈の原因となる、または関連する新しい遺伝子バリアントを発見します。 これらの疾患の分子疫学を決定します。 これらの疾患の分子基盤をよりよく理解するための証拠を見つけてください。

実験モデルの作成を許可します。 発生の遺伝的パターンを決定します (とりわけ、継承または新規)。 診断の改善を許可します。 遺伝カウンセリングの改善を可能にします。

仮説 遺伝子解析は、患者とその家族の診断と遺伝カウンセリングを改善するでしょう。 早期診断により、場合によっては突然死を防ぐことができます。 チャネロパシーに関連する新しい遺伝子変異を検出する可能性があります。

方法 研究デザインと母集団 Rede D'Or の不整脈グループを伴う 20 人の患者と 80 人の家族 (合計 100 人) が募集されます。 研究に含まれる個人の総数は、研究の一部であるRede D'Orの専門家グループとその家族が現在フォローしている患者に基づく便宜上のサンプルを指します。 発端者ごとに最大 4 人の家族メンバーを選択することは、ほとんどの場合、この数の関連する個人が表現型の発生パターンと分離を決定するのに十分であるという事実によって正当化されます。

含まれる各発端者の家族の特定は、遺伝的継承のパターン、家族構成、および他の家族メンバーからのサンプルの入手可能性に応じて、ケースバイケースで行われます。 原因となる遺伝的バリアントの遺伝パターン、または心臓チャネル病としてまとめて定義された表現型に関連するものの遺伝パターンは、より一般的には常染色体優性です。 この文脈では、両親の遺伝子検査、および可能であれば、表現型によって影響を受けるかどうかにかかわらず、第一度近親者の遺伝子検査は、因果関係の確立または除外に十分です。 あまり一般的ではありませんが、散発的なケースも見られます。 そのような場合、病原性遺伝子変異は両親で検出されるべきではありませんが、散発的なパターンを確認するためにそれらをテストする必要があります. このような場合、兄弟姉妹および/または第一度近親者は、両親が不在の場合にのみ検査する必要があります。

これは、わが国でこれらの病気の影響を受ける人口に関する情報を提供するパイロット研究です。 チャネロパシーの影響を受け、リオデジャネイロのRede D'Or São Luizに属する病院や診療所でフォローアップされているすべての適格な患者と、選択された家族が研究に参加するよう招待されます。 DNAシーケンシングは、組み入れから3±2か月後に行われます。 表現型分析は、組み入れから2±1か月後に実行され、臨床評価、心エコー検査、24時間ホルター、または長時間の心電図モニタリングで構成されます（データ収集フォーム - 付録B）。 含まれる症例の完全かつ統合された遺伝子型 - 表現型分析が行われます。 患者とその家族は、最低2年間、最高5年間追跡され、臨床相談および上記と同じ補完的な方法で毎年評価されます。

手順 DNA サンプルの収集と精製 ゲノム DNA は、末梢血または口腔スワブから精製されます。 全血は、抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを含有する試験管において、末梢採血によって収集される。 血液サンプルは、DNA 精製まで 1 週間まで 4 ～ 8 oC で保存されます。 口腔スワブは、ORAcollect • DNA キット (OCR-100) (DNA Genotek Inc.、カナダ) を使用して収集されます。 全血または口腔スワブサンプルからのゲノムDNAは、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を使用して精製されます。

サンガー法または新世代シーケンシングによる DNA シーケンシングによる生殖細胞系列の遺伝的バリアント (継承または de novo) の分析は、DNA が精製される組織または体液の影響を受けません。 したがって、末梢血または口腔スメア/唾液は、技術的な妥協やバイアスの導入なしに DNA のソースとして使用できます。 したがって、血液または口腔スワブの選択は、本質的に研究参加者の快適さと利便性によって決定され、利用可能なリソースの合理的な使用を目指しています。

ＤＮＡの定量化および品質管理 精製されたゲノムＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐマイクロボリューム分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して紫外分光測光法によって定量化される。 DNAの完全性は、アガロースゲル電気泳動およびAgilent 4200 TapeStationシステムを使用して測定されます。

遺伝子分析戦略 最初の発見段階では、選択された候補遺伝子のパネル内の配列およびコピー数バリアントの分析のために、20 人の発端者が選択されます。 この初期段階で特定された疑わしい因果変数は、その後、発端者ごとに最大 4 人の家族または第一度近親者で分析されます。

遺伝子パネルと遺伝子選択基準 パネルに含まれる候補遺伝子は、パネルと専門学会が発行した文献とコンセンサス、推奨事項、およびガイドラインを検討することにより、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) データベースでの検索から選択されました。 候補遺伝子の最終リストは、臨床的に有益な遺伝子、すなわち、診断または治療の決定を支援する遺伝子、および不整脈の病態生理学における遺伝的関与を示す実験的証拠を含むように確立されました。

新世代シーケンシング 新世代シーケンシングを使用して、候補遺伝子を解析し、配列およびコピー数バリアントを検出します。 コード領域全体とイントロンとエクソンの境界は、Ampliseq ™ テクノロジーを使用して配列決定されます。 関心領域の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、オンライン ツール Ion AmpliSeq Designer を使用して設計されます。 シーケンス ライブラリは、Ion OneTouch 2 システム (ThermoFisher Scientific) で Ion AmpliSeq ™ ライブラリ キットを使用して生成されます。 シーケンスは、Ion 318™ Chip v2 BC および Ion PGM™ Hi-Q™ View Sequencing 試薬 (ThermoFisher Scientific) を使用して、Ion Personal Genome Machine (PGM) シーケンサーで実行されます。 Ｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（商標）ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して配列決定分析を実施する。

配列バリアントの解釈と報告。 配列バリアントの解釈と登録は、American College of Medical Genetics and Genomics、The Association for Molecular Pathology、および College of American Pathologists の合意に基づく推奨に従って行われます。 手短に言えば、メンデル障害を引き起こす遺伝子で同定されたバリアントを説明するために、このコンセンサスは標準的な用語の使用を推奨しています: 病原性、おそらく病原性、意味不明、おそらく良性および良性。 この勧告によると、これらの 5 つのカテゴリにバリアントを分類するプロセスは、集団データ、コンピューター シミュレーション、機能データ、遺伝的分離データなど、一連のさまざまな種類の証拠に基づいています。

検出された遺伝子変異の病原性の評価は、専門家によって独立して、つまり「ブラインド」で行われます。 患者の臨床評価と表現型の決定は、Nilson Araújo 博士の監督の下、グループの不整脈専門医によって実施されます。 遺伝的評価は、マルセロ・レイス博士によって「盲目的」に行われます。 発見されたバリアントと表現型の間に相違がある場合、その結果は、Luciana Sacilotto 博士 (臨床遺伝学の経験を持つ不整脈の専門家) と Carolina Bustamante 博士 (分子遺伝学の専門家) によってレビューされます。

遺伝的バリアントの機能的効果の計算による予測 配列バリアントの機能的効果を推定するために、公開されている一連のツールが使用されます。 これらのアルゴリズムは、アミノ酸残基と保存されたタンパク質ドメインの進化的保存、タンパク質の構造と機能、飛電マルコフ モデル、および位置依存ロジックを考慮します。 特定の配列バリアントの効果に関する in vitro での機能実験データが入手可能であれば、それも解釈のために考慮されます。