Genetisk analyse av hjertekanalopatier hos brasilianske pasienter og deres slektninger

Arvelige arytmier er preget av variabel uttrykksevne og ufullstendig penetrans. Omfattende genotype-fenotype studier er nødvendig for å belyse det genetiske grunnlaget for disse sykdommene. Det er flere grunner til å studere den molekylære genetikken til kanalopatier, for eksempel å bestemme den molekylære epidemiologien til disse sykdommene, å tilby bevis for en bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for sykdommer, å bestemme de genetiske mønstrene for forekomst (arvet eller igjen), og forbedre diagnose og genetisk veiledning. Dessuten kan den genetiske studien av disse sykdommene føre til oppdagelsen av nye genetiske varianter assosiert med disse sykdommene og til etableringen av eksperimentelle modeller.

Genetisk testing anbefales (klasse I) for alle pasienter med sterk klinisk mistanke om genetisk arvelige kanalopatier inkludert langt QT-syndrom, katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi, Brugada-syndrom og kort QT-syndrom. Spesifikk genetisk testing for mutasjonen identifisert i indekstilfellet anbefales også (klasse I) for familiemedlemmer.

Den molekylære genetikken til hjertekanalopatier har blitt grundig studert i populasjoner i utviklede land. Tidligere var de mest brukte metodene sekvensering av et enkelt eller noen få mistenkte gener. Nylig har bredere paneler eller til og med sekvenseringen av det komplette eksomet blitt brukt i økende grad. Denne prosedyren har gjort det mulig å oppdage et økende antall genetiske varianter.

Selv om det genetiske grunnlaget for mange tilfeller av disse sykdommene er kjent, har mange familier ennå ikke en sikker genetisk årsak. Dessuten er det vanskelig å forutsi patogenisiteten og den kliniske utviklingen av individuelle mutasjoner. Nylige fremskritt innen generering av induserte pluripotente stamceller (iPS) kan tillate betydelig fremgang i translasjonsforskningen av arytmier.

Siden oppdagelsen av den første kanalopatien i 1995 har bruken av genetiske tester for diagnostiske og prognostiske formål utviklet seg betraktelig og brukes nå i klinisk praksis og ikke bare til forskningsformål. Til tross for alle disse fremskrittene, er bruken av DNA-sekvensering for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av noen sykdommer en utfordring, siden alle disse kliniske syndromene kan assosieres med forskjellige mutasjoner, hvorav mange ennå ikke er beskrevet. Den genetiske sekvenseringen av pasienter med genetisk arvelige arytmier er viktig ikke bare for å gi klinisk informasjon relatert til godt karakteriserte mutasjoner, men også for å bidra til oppdagelsen av nye genetiske endringer. I Brugada syndrom, for eksempel, selv om 12 genotyper har blitt beskrevet så langt, har genetiske endringer blitt identifisert i bare 30% av tilfellene. Årsaken til disse avvikene er knyttet til fortsatt ufullstendig kunnskap om alle banene som er involvert i funksjon og regulering av hjerte-ionekanaler.

Korte beskrivelser av de mest studerte kanalopatiene er presentert nedenfor. Langt QT-syndrom (LQTS) Denne sykdommen har blitt identifisert i forskjellige områder av verden, i forskjellige etniske grupper. Selv om minst 13 former for sykdommen er beskrevet så langt, er årsaken i omtrent 20 % av tilfellene ennå ikke definert.

Sykdommen er preget av en forlengelse av QT-intervallet og arytmiske hendelser. Arytmiene som vanligvis finnes hos disse pasientene er episoder med polymorf ventrikkeltakykardi (torsades de pointes) som forårsaker svimmelhet og synkope og kan utvikle seg til ventrikkelflimmer og plutselig død. Individer som er berørt av LQTS er mer utsatt for atrieflimmer enn den generelle befolkningen. Dette er den mest studerte kanalopatien, og korrelasjonen mellom genetiske varianter og klinisk evolusjon er svært høy. Foreløpig er det kjent at trening og følelsesmessig stress utløser arytmier hos pasienter med LQT1 og at pasienter med LQT3 vanligvis har episoder med arytmi under søvn. Det er også kjent at LQT8 er ekstremt aggressiv med symptomer som vises tidlig og dårlig respons på behandlingen. Minst 20 % av genetisk påviste LQTS-tilfeller har normalt EKG. Av alle disse grunnene er LQTS et eksempel på hvordan genetisk karakterisering kan hjelpe til med å forstå patofysiologien til en klinisk tilstand og forbedre behandlingen.

Brugada-syndrom (BRS) Dette kliniske syndromet er preget av spontane episoder av polymorf ventrikkeltakykardi som kan degenerere til ventrikkelflimmer og et typisk elektrokardiografisk mønster av forhøyning av ST-segmentet fra V1 til V3.

Forekomsten av denne sykdommen er høyere i Asia, hvor den enkelte steder anses som den vanligste årsaken til naturlig død blant menn under 50 år.

Syndromet begynner vanligvis i voksen alder, og er sjeldent hos barn. Flere genotyper er allerede beskrevet, typisk med en reduksjon i strømmen av natrium (Na) eller en økning i strømmen av kalium (K). Mønsteret for arv er autosomalt dominant, så halvparten av familiemedlemmene forventes å bli påvirket. Som nevnt tidligere for LQTS, er molekylærgenetikken til flere tilfeller med kliniske kriterier for Brugada syndrom ennå ikke belyst.

Valget behandling er implantasjon av en defibrillator. Ingen farmakologisk behandling er trygg, selv om isoproterenol eller kinidin kan brukes i tilfeller av elektriske stormer. Ablasjon blir undersøkt for å kontrollere noen av disse pasientene.

Diagnosen stilles fra elektrokardiogrammet (EKG) med et typisk mønster assosiert med klinisk bevis på sykdommen. Noen ganger kan en provoserende medikamenttest være nødvendig, da det typiske mønsteret kan være forbigående. Blokkere av Na-kanaler som ajmaline kan bidra til å identifisere disse pasientene.

Katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) Denne sykdommen er karakterisert ved arytmiske hendelser med toveis eller polymorf ventrikkeltakykardi utløst av en adrenerg stimulus. Baseline EKG og bildediagnostikktester er uspesifikke. Ventrikulære arytmier observeres utelukkende under innsats, slik at stresstesten og Holter er viktige diagnostiske metoder. To typer mutasjoner har blitt beskrevet så langt. En ved ryanodinreseptoren og den andre ved genet som koder for calsequestrin. Bare 60 % av diagnostiserte individer bærer en av disse mutasjonene, og derfor må andre gener være involvert. Andre tilstander Flere andre arytmiske genetiske syndromer er beskrevet, som kort QT-syndrom, plutselig uforklarlig dødssyndrom, idiopatisk ventrikkelflimmer, tidlig repolarisering og noen genetiske former for atrieflimmer. Mange pasienter får diagnosen etter en episode med plutselig abortert død. Bedre genetisk kategorisering av disse tilfellene kan bidra til bedre å forstå mekanismene involvert i disse sykdommene og forbedre behandlingen. Familiescreening og adekvat genetisk rådgivning er avgjørende.

MÅL PRIMÆR MÅL Denne studien tar sikte på å utføre en omfattende genetisk analyse av hjertekanalopatier hos brasilianske pasienter og deres familier.

SEKUNDÆRE MÅL Oppdag nye genetiske varianter som er kausale eller assosiert med arytmier. Bestem den molekylære epidemiologien til disse sykdommene. Finn bevis for en bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for disse sykdommene.

Tillat opprettelse av eksperimentelle modeller. Bestem de genetiske mønstrene for forekomst (arvet eller ny, blant andre). Tillat en forbedring av diagnosen. Muliggjøre en forbedring i genetisk rådgivning.

HYPOTESER Genetisk analyse vil forbedre diagnosen og genetisk veiledning til pasienter og deres familier. Tidlig diagnose kan i noen tilfeller forhindre plutselig død. Det er en mulighet for å oppdage nye genetiske varianter assosiert med kanalopatier.

METODER STUDIEDESIGN OG BEFOLKNING 20 pasienter og 80 familiemedlemmer (totalt 100 individer) ledsaget av arytmigruppen til Rede D'Or vil bli rekruttert. Det totale antallet individer som skal inkluderes i studien refererer til et bekvemmelighetsutvalg basert på pasienter som for tiden følges av gruppen spesialister fra Rede D'Or som er en del av studien og deres familier. Valget av opptil 4 familiemedlemmer per proband er begrunnet med det faktum at dette antallet beslektede individer i de fleste tilfeller er tilstrekkelig til å bestemme mønsteret for forekomst og segregering av fenotyper.

Spesifikasjonen av familiemedlemmene til hver proband som vil bli inkludert vil bli gjort fra sak til sak avhengig av mønsteret av genetisk arv, familiesammensetningen og tilgjengeligheten av prøver fra andre familiemedlemmer. Arvemønsteret til kausale genetiske varianter eller de som er assosiert med fenotyper som i fellesskap er definert som hjertekanalopatier er, mer vanlig, autosomalt dominant. I denne sammenheng er genetisk testing av begge foreldrene og, når det er mulig, av førstegradsslektninger som er berørt eller ikke av fenotypen tilstrekkelig for å fastslå eller utelukke årsakssammenheng. Selv om det er mindre vanlige, kan sporadiske tilfeller også sees. I slike tilfeller bør den patogene genetiske varianten ikke oppdages hos foreldrene, men å teste dem er nødvendig for å bekrefte det sporadiske mønsteret. I disse tilfellene skal søsken og/eller førstegradsslektninger kun testes i fravær av foreldrene.

Dette er en pilotstudie som skal gi informasjon om befolkningen som er rammet av disse sykdommene i vårt land. Alle kvalifiserte pasienter, rammet av kanalopatier og fulgt opp på sykehus og klinikker tilhørende Rede D'Or São Luiz i Rio de Janeiro og utvalgte familiemedlemmer, vil bli invitert til å delta i studien. DNA-sekvensering vil bli utført 3 ± 2 måneder etter inkludering. Den fenotypiske analysen vil bli utført 2 ± 1 måneder etter inklusjon og vil bestå av en klinisk evaluering, ekkokardiografi, 24-timers Holter, eller forlenget elektrokardiografisk overvåking (datainnsamlingsskjema - Vedlegg B). En komplett og integrert genotype-fenotype analyse av de inkluderte tilfellene vil bli utført. Pasienter og deres familier vil bli fulgt i minimum 2 år og maksimalt 5 år og de vil bli evaluert årlig med kliniske konsultasjoner og med de samme komplementære metodene beskrevet ovenfor.

PROSEDYRER Innsamling og rensing av DNA-prøver Genomisk DNA vil bli renset fra perifert blod eller munnprøver. Fullblod vil bli samlet ved perifer flebotomi i rør som inneholder K2EDTA som antikoagulant. Blodprøver vil bli lagret ved 4-8 oC i inntil en uke før DNA-rensing. Munnpinner vil bli samlet inn med ORAcollect • DNA-settet (OCR-100) (DNA Genotek Inc., Canada). Genomisk DNA fra fullblod eller munnpinneprøver vil bli renset med DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN).

Analysen av genetiske varianter av kimlinje (arvet eller de novo) gjennom DNA-sekvensering, enten ved Sanger-metoden eller ved ny generasjons sekvensering, påvirkes ikke av vevet eller kroppsvæsken som DNAet er renset fra. Derfor kan perifert blod eller orale utstryk/spytt brukes som en kilde til DNA uten noe teknisk kompromiss eller introduksjon av skjevhet. Dermed vil valget av blod eller oral vattpinne i hovedsak bestemmes av komforten og bekvemmeligheten for forskningsdeltakeren og sikte på rasjonell bruk av de tilgjengelige ressursene.

DNA kvantifisering og kvalitetskontroll Det rensede genomiske DNA vil bli kvantifisert ved ultrafiolett spektrofotometri ved bruk av NanoDrop mikrovolumspektrofotometer (ThermoFisher Scientific). DNA-integritet vil bli målt ved agarosegelelektroforese og ved bruk av Agilent 4200 TapeStation-systemet.

Genetisk analysestrategi I den innledende oppdagelsesfasen vil 20 probander bli valgt ut for analyse av sekvens- og kopinummervarianter innenfor et panel av utvalgte kandidatgener. De mistenkelige årsaksvariablene identifisert i denne innledende fasen vil senere bli analysert i opptil 4 familiemedlemmer eller førstegradsslektninger for hver proband.

Genetiske panel- og genutvelgelseskriterier Kandidatgener inkludert i panelet ble valgt ut fra søk i databasen Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), ved å gjennomgå litteraturen og konsensus, anbefalinger og retningslinjer utstedt av paneler og spesialistforeninger. Den endelige listen over kandidatgener ble etablert for å inkludere klinisk informative gener, dvs. som hjelper til med diagnostiske eller terapeutiske beslutninger, og eksperimentelle bevis som indikerer genetisk involvering i patofysiologien til arytmier.

Ny generasjons sekvensering Kandidatgener vil bli analysert for påvisning av sekvens- og kopinummervarianter ved bruk av ny generasjons sekvensering. Hele den kodende regionen og intron-ekson-grensene vil bli sekvensert ved bruk av Ampliseq™-teknologi. Oligonukleotidene for amplifisering av regionene av interesse vil bli designet ved å bruke det elektroniske verktøyet Ion AmpliSeq Designer. Sekvenseringsbibliotekene vil bli generert ved hjelp av Ion AmpliSeq™ Library Kit på Ion OneTouch 2-systemet (ThermoFisher Scientific). Sekvenseringen vil bli utført på en Ion Personal Genome Machine (PGM)-sekvenser ved å bruke Ion 318 ™ Chip v2 BC og Ion PGM ™ Hi-Q ™ View Sequencing-reagenser (ThermoFisher Scientific). Sekvensanalyse vil bli utført ved hjelp av Ion Reporter™-programvaren (ThermoFisher Scientific).

Tolking og rapportering av sekvensvarianter. Tolkning og registrering av sekvensvarianter vil bli utført i henhold til konsensusanbefalingen fra American College of Medical Genetics and Genomics, Association for Molecular Pathology og College of American Pathologists. Kort fortalt, for å beskrive varianter identifisert i gener som forårsaker Mendelske lidelser, anbefaler denne konsensus bruk av standarduttrykk: patogen, sannsynligvis patogen, usikker betydning, sannsynlig godartet og godartet. I henhold til denne anbefalingen er prosessen med å klassifisere varianter i disse fem kategoriene basert på en rekke forskjellige typer bevis, som befolkningsdata, datasimuleringer, funksjonelle data og genetiske segregeringsdata.

Evalueringen av patogenisiteten til de genetiske variantene som oppdages vil bli gjort uavhengig, dvs. "blind", av spesialistene. Den kliniske evalueringen av pasientene og bestemmelse av fenotypen vil bli utført av arytmispesialistene i gruppen under veiledning av Dr. Nilson Araújo. Den genetiske evalueringen vil bli gjort på en "blind" måte av Dr. Marcelo Reis. Ved divergens mellom den funnet varianten og fenotypen vil funnene bli gjennomgått av Dr. Luciana Sacilotto (spesialist i arytmi med erfaring innen klinisk genetikk) og av Dr. Carolina Bustamante (spesialist i molekylær genetikk).

Beregningsprediksjon av den funksjonelle effekten av genetiske varianter For å estimere de funksjonelle effektene av sekvensvariantene, vil en rekke offentlig tilgjengelige verktøy brukes. Disse algoritmene vurderer evolusjonær bevaring av aminosyrerester og konserverte proteindomener, proteinstruktur og funksjon, Hiden Markov-modeller og posisjonsavhengig logikk. Når tilgjengelig, vil funksjonelle eksperimentelle data in vitro om effekten av spesifikke sekvensvarianter også vurderes for tolkning.