Análisis Genético de Canalopatías Cardíacas en Pacientes Brasileños y sus Familiares

Las arritmias hereditarias se caracterizan por una expresividad variable y una penetrancia incompleta. Se necesitan extensos estudios de genotipo-fenotipo para dilucidar la base genética de estas enfermedades. Hay varias razones para estudiar la genética molecular de las canalopatías, como determinar la epidemiología molecular de estas enfermedades, ofrecer evidencia para una mejor comprensión de las bases moleculares de las enfermedades, determinar los patrones genéticos de ocurrencia (heredados o de nuevo) y mejorar la diagnóstico y consejo genético. Además, el estudio genético de estas enfermedades puede conducir al descubrimiento de nuevas variantes genéticas asociadas a estas enfermedades ya la creación de modelos experimentales.

Se recomiendan pruebas genéticas (Clase I) para cualquier paciente con una fuerte sospecha clínica de canalopatías heredadas genéticamente, incluido el síndrome de QT largo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, síndrome de Brugada y síndrome de QT corto. También se recomiendan pruebas genéticas específicas para la mutación identificada en el caso índice (Clase I) para los miembros de la familia.

La genética molecular de las canalopatías cardíacas ha sido ampliamente estudiada en poblaciones de países desarrollados. En el pasado, los métodos más utilizados eran la secuenciación de uno o varios genes sospechosos. Más recientemente, se han utilizado cada vez más paneles más amplios o incluso la secuenciación del exoma completo. Este procedimiento ha permitido el descubrimiento de un número creciente de variantes genéticas.

Aunque se conoce la base genética de muchos casos de estas enfermedades, muchas familias aún no tienen una causa genética definida. Además, es difícil predecir la patogenicidad y la evolución clínica de las mutaciones individuales. Los avances recientes en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) pueden permitir un progreso considerable en la investigación traslacional de las arritmias.

Desde el descubrimiento de la primera canalopatía en 1995, el uso de pruebas genéticas con fines diagnósticos y pronósticos ha evolucionado considerablemente y ahora se utiliza en la práctica clínica y no solo con fines de investigación. A pesar de todos estos avances, el uso de la secuenciación del ADN para determinar la presencia o ausencia de algunas enfermedades es un reto, ya que todos estos síndromes clínicos pueden estar asociados a diferentes mutaciones, muchas de las cuales aún no han sido descritas. La secuenciación genética de pacientes con arritmias genéticamente heredadas es fundamental no solo para brindar información clínica relacionada con mutaciones bien caracterizadas sino también para contribuir al descubrimiento de nuevas alteraciones genéticas. En el síndrome de Brugada, por ejemplo, aunque hasta el momento se han descrito 12 genotipos, solo se han identificado cambios genéticos en el 30% de los casos. La razón de estas discrepancias está relacionada con el conocimiento aún incompleto de todas las vías involucradas en la función y regulación de los canales iónicos cardíacos.

A continuación se presentan breves descripciones de las canalopatías más estudiadas. Síndrome de QT largo (SQTL) Esta enfermedad ha sido identificada en diferentes áreas del mundo, en diferentes grupos étnicos. Aunque hasta el momento se han descrito al menos 13 formas de la enfermedad, la causa en aproximadamente el 20% de los casos aún no está definida.

La enfermedad se caracteriza por una prolongación del intervalo QT y eventos arrítmicos. Las arritmias que suelen encontrarse en estos pacientes son episodios de taquicardia ventricular polimórfica (torsades de pointes) que provocan mareos y síncope y pueden progresar a fibrilación ventricular y muerte súbita. Los individuos afectados por SQTL son más susceptibles a la fibrilación auricular que la población general Siendo esta la canalopatía más estudiada, la correlación entre las variantes genéticas y la evolución clínica es muy alta. Actualmente se sabe que el ejercicio y el estrés emocional desencadenan arritmias en pacientes con LQT1 y que los pacientes con LQT3 suelen tener episodios de arritmia durante el sueño. También se sabe que LQT8 es extremadamente agresivo con síntomas que aparecen temprano y una mala respuesta al tratamiento. Al menos el 20 % de los casos de LQTS probados genéticamente tienen un ECG normal. Por todas estas razones, LQTS es un ejemplo de cómo la caracterización genética puede ayudar a comprender la fisiopatología de una condición clínica y mejorar el tratamiento.

Síndrome de Brugada (BRS) Este síndrome clínico se caracteriza por episodios espontáneos de taquicardia ventricular polimórfica que pueden degenerar en fibrilación ventricular y un patrón electrocardiográfico típico de elevación del segmento ST de V1 a V3.

La prevalencia de esta enfermedad es mayor en Asia donde, en algunos lugares, se considera la causa más común de muerte natural entre los hombres menores de 50 años.

El síndrome suele comenzar en la edad adulta, siendo raro en niños. Ya se han descrito varios genotipos, típicamente implicando una disminución en las corrientes de sodio (Na) o un aumento en las corrientes de potasio (K). El patrón de herencia es autosómico dominante, por lo que se espera que la mitad de los miembros de la familia estén afectados. Como se mencionó anteriormente para LQTS, la genética molecular de varios casos con criterios clínicos para el síndrome de Brugada aún no se ha dilucidado.

El tratamiento de elección es la implantación de un desfibrilador. Ningún tratamiento farmacológico es seguro, aunque se puede utilizar isoproterenol o quinidina en casos de tormentas eléctricas. Se está investigando la ablación para controlar a algunos de estos pacientes.

El diagnóstico se realiza a partir del electrocardiograma (ECG) con un patrón típico asociado a la evidencia clínica de la enfermedad. Ocasionalmente puede ser necesaria una prueba de provocación de drogas, ya que el patrón típico puede ser transitorio. Los bloqueadores de los canales de Na como la ajmalina pueden ayudar a identificar a estos pacientes.

Taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) Esta enfermedad se caracteriza por eventos arrítmicos de taquicardia ventricular bidireccional o polimórfica desencadenada por un estímulo adrenérgico. El ECG basal y las pruebas de imagen son inespecíficos. Las arritmias ventriculares se observan exclusivamente durante los esfuerzos por lo que la prueba de esfuerzo y el Holter son importantes métodos diagnósticos. Hasta ahora se han descrito dos tipos de mutaciones. Uno en el receptor de rianodina y el otro en el gen que codifica calsecuestrina. Solo el 60% de los individuos diagnosticados portan una de estas mutaciones y, por lo tanto, otros genes deben estar involucrados. Otras condiciones Se han descrito varios otros síndromes genéticos arrítmicos, como el síndrome de QT corto, el síndrome de muerte súbita inexplicable, la fibrilación ventricular idiopática, la repolarización temprana y algunas formas genéticas de fibrilación auricular. Muchos pacientes son diagnosticados después de un episodio de muerte súbita abortada. Una mejor categorización genética de estos casos podría ayudar a comprender mejor los mecanismos involucrados en estas enfermedades y mejorar el tratamiento. El cribado familiar y el asesoramiento genético adecuado son esenciales.

OBJETIVOS OBJETIVO PRIMARIO Este estudio tiene como objetivo realizar un análisis genético integral de las canalopatías cardíacas en pacientes brasileños y sus familias.

OBJETIVOS SECUNDARIOS Descubrir nuevas variantes genéticas causales o asociadas a arritmias. Determinar la epidemiología molecular de estas enfermedades. Encuentre evidencia para una mejor comprensión de la base molecular de estas enfermedades.

Permitir la creación de modelos experimentales. Determinar los patrones genéticos de ocurrencia (heredados o nuevos, entre otros). Permitir una mejora en el diagnóstico. Permitir una mejora en el asesoramiento genético.

HIPÓTESIS El análisis genético mejorará el diagnóstico y el consejo genético de los pacientes y sus familias. El diagnóstico temprano puede prevenir la muerte súbita en algunos casos. Existe la posibilidad de detectar nuevas variantes genéticas asociadas a canalopatías.

MÉTODOS DISEÑO DEL ESTUDIO Y POBLACIÓN Se reclutarán 20 pacientes y 80 familiares (un total de 100 individuos) acompañados del grupo de arritmias de la Rede D'Or. El número total de personas a incluir en el estudio se refiere a una muestra de conveniencia basada en los pacientes actualmente seguidos por el grupo de especialistas de la Rede D'Or que forman parte del estudio y sus familias. La elección de hasta 4 familiares por probando se justifica por el hecho de que este número de individuos emparentados es, en la mayoría de los casos, suficiente para determinar el patrón de ocurrencia y segregación de fenotipos.

La especificación de los miembros de la familia de cada probando que se incluirá se hará caso por caso dependiendo del patrón de herencia genética, la composición de la familia y la disponibilidad de muestras de otros miembros de la familia. El patrón de herencia de las variantes genéticas causales o las asociadas a fenotipos definidos conjuntamente como canalopatías cardíacas es, más comúnmente, autosómico dominante. En este contexto, el estudio genético de ambos progenitores y, cuando sea posible, de los familiares en primer grado afectados o no por el fenotipo es suficiente para establecer o excluir la causalidad. Aunque menos común, también se pueden ver casos esporádicos. En tales casos, la variante genética patógena no debe detectarse en los padres, pero es necesario analizarlos para confirmar el patrón esporádico. En estos casos, los hermanos y/o familiares de primer grado sólo deberán ser examinados en ausencia de los padres.

Se trata de un estudio piloto que permitirá conocer la población afectada por estas enfermedades en nuestro país. Todos los pacientes elegibles, afectados por canalopatías y seguidos en hospitales y clínicas pertenecientes a la Rede D'Or São Luiz en Río de Janeiro y familiares seleccionados, serán invitados a participar en el estudio. La secuenciación del ADN se realizará 3 ± 2 meses después de la inclusión. El análisis fenotípico se realizará a los 2 ± 1 meses de la inclusión y consistirá en evaluación clínica, ecocardiografía, Holter de 24 horas o seguimiento electrocardiográfico prolongado (ficha de recogida de datos - Anexo B). Se realizará un análisis genotipo-fenotipo completo e integrado de los casos incluidos. Los pacientes y sus familias serán seguidos durante un mínimo de 2 años y un máximo de 5 años y serán evaluados anualmente con consultas clínicas y con los mismos métodos complementarios descritos anteriormente.

PROCEDIMIENTOS Recolección y purificación de muestras de ADN El ADN genómico se purificará a partir de sangre periférica o hisopos bucales. Se recolectará sangre entera por flebotomía periférica en tubos que contienen K2EDTA como anticoagulante. Las muestras de sangre se almacenarán a 4-8 oC hasta una semana antes de la purificación del ADN. Los hisopos bucales se recogerán utilizando el kit de ADN ORAcollect • (OCR-100) (DNA Genotek Inc., Canadá). El ADN genómico de muestras de sangre total o de hisopos bucales se purificará con el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN).

El análisis de variantes genéticas de línea germinal (heredadas o de novo) mediante secuenciación de ADN, ya sea por el método de Sanger o por secuenciación de nueva generación, no está influenciado por el tejido o fluido corporal a partir del cual se purifica el ADN. Por lo tanto, la sangre periférica o los frotis orales/saliva pueden usarse como fuente de ADN sin ningún compromiso técnico o introducción de sesgo. Así, la elección de sangre o hisopo oral será determinada esencialmente por la comodidad y conveniencia para el participante de la investigación y visando el uso racional de los recursos disponibles.

Cuantificación y control de calidad del ADN El ADN genómico purificado se cuantificará mediante espectrofotometría ultravioleta utilizando el espectrofotómetro de microvolúmenes NanoDrop (ThermoFisher Scientific). La integridad del ADN se medirá mediante electroforesis en gel de agarosa y utilizando el sistema Agilent 4200 TapeStation.

Estrategia de análisis genético En la fase de descubrimiento inicial, se seleccionarán 20 probandos para el análisis de variantes de secuencia y número de copias dentro de un panel de genes candidatos seleccionados. Las variables causales sospechosas identificadas en esta fase inicial serán posteriormente analizadas en hasta 4 familiares o familiares de primer grado por cada probando.

Panel genético y criterios de selección de genes Los genes candidatos incluidos en el panel se seleccionaron a partir de búsquedas en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), mediante la revisión de la literatura y el consenso, las recomendaciones y las pautas emitidas por paneles y sociedades especializadas. La lista final de genes candidatos se estableció para incluir genes clínicamente informativos, es decir, que ayuden en decisiones diagnósticas o terapéuticas, y evidencia experimental indicativa de participación genética en la fisiopatología de las arritmias.

Secuenciación de nueva generación Los genes candidatos se analizarán para la detección de variantes de secuencia y número de copias mediante secuenciación de nueva generación. Toda la región de codificación y los límites entre intrones y exones se secuenciarán utilizando la tecnología Ampliseq™. Los oligonucleótidos para la amplificación de las regiones de interés se diseñarán mediante la herramienta online Ion AmpliSeq Designer. Las bibliotecas de secuenciación se generarán utilizando el kit de biblioteca Ion AmpliSeq ™ en el sistema Ion OneTouch 2 (ThermoFisher Scientific). La secuenciación se realizará en un secuenciador Ion Personal Genome Machine (PGM) utilizando el Ion 318 ™ Chip v2 BC y los reactivos Ion PGM ™ Hi-Q ™ View Sequencing (ThermoFisher Scientific). El análisis de secuenciación se realizará utilizando el software Ion Reporter™ (ThermoFisher Scientific).

Interpretación y reporte de variantes de secuencia. La interpretación y registro de las variantes de secuencia se realizará de acuerdo con la recomendación consensuada del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica, la Asociación de Patología Molecular y el Colegio de Patólogos Americanos. Brevemente, para describir variantes identificadas en genes que causan trastornos mendelianos, este consenso recomienda el uso de términos estándar: patógeno, probablemente patógeno, significado incierto, probablemente benigno y benigno. De acuerdo con esta recomendación, el proceso de clasificación de variantes en estas cinco categorías se basa en una serie de diferentes tipos de evidencia, como datos de población, simulaciones por computadora, datos funcionales y datos de segregación genética.

La evaluación de la patogenicidad de las variantes genéticas que se detecten se hará de forma independiente, es decir, "a ciegas", por parte de los especialistas. La evaluación clínica de los pacientes y la determinación del fenotipo serán realizadas por los especialistas en arritmias del grupo bajo la supervisión del Dr. Nilson Araújo. La evaluación genética se hará de forma 'ciega' por el Dr. Marcelo Reis. En caso de divergencia entre la variante encontrada y el fenotipo, los hallazgos serán revisados ​​por la Dra. Luciana Sacilotto (especialista en arritmias con experiencia en genética clínica) y por la Dra. Carolina Bustamante (especialista en genética molecular).

Predicción computacional del efecto funcional de las variantes genéticas Para estimar los efectos funcionales de las variantes de secuencia se utilizarán una serie de herramientas disponibles públicamente. Estos algoritmos consideran la conservación evolutiva de los residuos de aminoácidos y los dominios de proteínas conservados, la estructura y función de las proteínas, los modelos de Hiden Markov y la lógica dependiente de la posición. Siempre que estén disponibles, los datos experimentales funcionales in vitro sobre el efecto de variantes de secuencia específicas también se considerarán para la interpretación.