Genetická analýza srdečních kanálopatií u brazilských pacientů a jejich příbuzných

Dědičné arytmie se vyznačují proměnlivou expresivitou a neúplnou penetrancí. K objasnění genetického základu těchto onemocnění jsou zapotřebí rozsáhlé studie genotypu a fenotypu. Existuje několik důvodů pro studium molekulární genetiky kanálopatií, jako je stanovení molekulární epidemiologie těchto onemocnění, poskytnutí důkazů pro lepší pochopení molekulárního základu onemocnění, stanovení genetických vzorců výskytu (zděděných nebo znovu) a zlepšení diagnostiku a genetické poradenství. Kromě toho může genetické studium těchto chorob vést k objevu nových genetických variant spojených s těmito chorobami a k ​​vytvoření experimentálních modelů.

Genetické vyšetření (třída I) se doporučuje u každého pacienta se silným klinickým podezřením na geneticky dědičné kanálopatie včetně syndromu dlouhého QT intervalu, katecholaminergní polymorfní ventrikulární tachykardie, Brugadova syndromu a syndromu krátkého QT. Specifické genetické testování na mutaci identifikovanou v případě indexu se také doporučuje (třída I) pro rodinné příslušníky.

Molekulární genetika srdečních kanálopatií byla rozsáhle studována v populacích ve vyspělých zemích. V minulosti byly nejčastěji používané metody sekvenování jednoho nebo několika podezřelých genů. V poslední době se stále více používají širší panely nebo dokonce sekvenování kompletního exomu. Tento postup umožnil objev rostoucího počtu genetických variant.

Přestože je znám genetický základ mnoha případů těchto onemocnění, mnoho rodin ještě nemá jednoznačnou genetickou příčinu. Kromě toho je obtížné předpovědět patogenitu a klinický vývoj jednotlivých mutací. Nedávné pokroky v generování indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS) mohou umožnit značný pokrok v translačním výzkumu arytmií.

Od objevení první kanálopatie v roce 1995 se používání genetických testů pro diagnostické a prognostické účely značně rozvinulo a nyní se používá v klinické praxi a nejen pro výzkumné účely. Přes všechny tyto pokroky je použití sekvenování DNA k určení přítomnosti nebo nepřítomnosti některých onemocnění výzvou, protože všechny tyto klinické syndromy mohou být spojeny s různými mutacemi, z nichž mnohé nebyly dosud popsány. Genetické sekvenování pacientů s geneticky zděděnými arytmiemi je nezbytné nejen pro poskytování klinických informací souvisejících s dobře charakterizovanými mutacemi, ale také pro přispění k objevu nových genetických změn. Například u syndromu Brugada, ačkoli bylo dosud popsáno 12 genotypů, byly genetické změny identifikovány pouze ve 30 % případů. Důvod těchto nesrovnalostí souvisí se stále neúplnými znalostmi o všech drahách zapojených do funkce a regulace srdečních iontových kanálů.

Stručné popisy nejvíce studovaných kanálopatií jsou uvedeny níže. Syndrom dlouhého QT intervalu (LQTS) Toto onemocnění bylo identifikováno v různých oblastech světa, u různých etnických skupin. Přestože bylo dosud popsáno nejméně 13 forem onemocnění, příčina v přibližně 20 % případů není dosud definována.

Onemocnění je charakterizováno prodloužením QT intervalu a arytmickými příhodami. Arytmie, které se u těchto pacientů obvykle vyskytují, jsou epizody polymorfní ventrikulární tachykardie (torsades de pointes), které způsobují závratě a synkopy a mohou progredovat do komorové fibrilace a náhlé smrti. Jedinci postižení LQTS jsou náchylnější k fibrilaci síní než běžná populace. Jelikož se jedná o nejvíce studovanou kanálopatii, korelace mezi genetickými variantami a klinickým vývojem je velmi vysoká. V současné době je známo, že cvičení a emoční stres spouští arytmie u pacientů s LQT1 a že pacienti s LQT3 mají obvykle epizody arytmie během spánku. Je také známo, že LQT8 je extrémně agresivní, symptomy se objevují brzy a je špatná odpověď na léčbu. Nejméně 20 % geneticky prokázaných případů LQTS má normální EKG. Ze všech těchto důvodů je LQTS příkladem toho, jak může genetická charakterizace pomoci pochopit patofyziologii klinického stavu a zlepšit léčbu.

Brugadův syndrom (BRS) Tento klinický syndrom je charakterizován spontánními epizodami polymorfní komorové tachykardie, která může degenerovat do ventrikulární fibrilace, a typickým elektrokardiografickým obrazem elevace ST segmentu z V1 do V3.

Prevalence tohoto onemocnění je vyšší v Asii, kde je v některých lokalitách považována za nejčastější příčinu přirozené smrti u mužů do 50 let.

Syndrom obvykle začíná v dospělosti, u dětí je vzácný. Bylo již popsáno několik genotypů, typicky zahrnujících snížení proudů sodíku (Na) nebo zvýšení proudů draslíku (K). Vzor dědičnosti je autozomálně dominantní, takže se očekává, že bude postižena polovina členů rodiny. Jak již bylo zmíněno dříve pro LQTS, molekulární genetika několika případů s klinickými kritérii pro Brugadův syndrom nebyla dosud objasněna.

Léčbou volby je implantace defibrilátoru. Žádná farmakologická léčba není bezpečná, i když v případech elektrických bouří lze použít isoproterenol nebo chinidin. Pro kontrolu některých z těchto pacientů se zkoumá ablace.

Diagnóza je stanovena na základě elektrokardiogramu (EKG) s typickým vzorem spojeným s klinickými známkami onemocnění. Občas může být nutný provokativní test na drogy, protože typický vzor může být přechodný. Blokátory Na kanálů, jako je ajmalin, mohou pomoci identifikovat tyto pacienty.

Katecholaminergní polymorfní ventrikulární tachykardie (CPVT) Toto onemocnění je charakterizováno arytmickými příhodami obousměrné nebo polymorfní komorové tachykardie spouštěnými adrenergním stimulem. Základní EKG a zobrazovací testy jsou nespecifické. Komorové arytmie jsou pozorovány výhradně během úsilí, takže zátěžový test a Holter jsou důležité diagnostické metody. Dosud byly popsány dva typy mutací. Jeden na ryanodinovém receptoru a druhý na genu kódujícím calsekvestrin. Pouze 60 % diagnostikovaných jedinců nese jednu z těchto mutací, a proto musí být zapojeny další geny. Jiné stavy Bylo popsáno několik dalších arytmických genetických syndromů, jako je syndrom krátkého QT intervalu, syndrom náhlého nevysvětlitelného úmrtí, idiopatická fibrilace komor, časná repolarizace a některé genetické formy fibrilace síní. Mnoho pacientů je diagnostikováno po epizodě náhlé potratové smrti. Lepší genetická kategorizace těchto případů by mohla pomoci lépe porozumět mechanismům podílejícím se na těchto onemocněních a zlepšit léčbu. Zásadní je rodinný screening a adekvátní genetické poradenství.

CÍLE PRIMÁRNÍ CÍL Cílem této studie je provést komplexní genetickou analýzu srdečních kanálopatií u brazilských pacientů a jejich rodin.

SEKUNDÁRNÍ CÍLE Objevte nové genetické varianty, které jsou kauzální nebo spojené s arytmiemi. Určit molekulární epidemiologii těchto onemocnění. Najděte důkazy pro lepší pochopení molekulárního základu těchto onemocnění.

Umožňuje tvorbu experimentálních modelů. Určete genetické vzorce výskytu (mimo jiné zděděné nebo nové). Umožněte zlepšení diagnostiky. Umožnit zlepšení genetického poradenství.

HYPOTÉZY Genetická analýza zlepší diagnostiku a genetické poradenství pacientů a jejich rodin. Včasná diagnóza může v některých případech zabránit náhlé smrti. Existuje možnost detekovat nové genetické varianty spojené s kanálopatiemi.

METODY NÁVRH A POPULACE STUDIE Bude přijato 20 pacientů a 80 rodinných příslušníků (celkem 100 jedinců) doprovázených skupinou arytmií Rede D'Or. Celkový počet jednotlivců, kteří mají být zahrnuti do studie, se vztahuje na vhodný vzorek založený na pacientech, které v současnosti sleduje skupina specialistů z Rede D'Or, kteří jsou součástí studie, a jejich rodiny. Volba až 4 rodinných příslušníků na probanda je odůvodněna tím, že tento počet příbuzných jedinců ve většině případů postačuje k určení vzorce výskytu a segregace fenotypů.

Specifikace rodinných příslušníků každého probanda, který bude zahrnut, bude proveden případ od případu v závislosti na vzoru genetické dědičnosti, složení rodiny a dostupnosti vzorků od ostatních členů rodiny. Dědičnost kauzálních genetických variant nebo variant spojených s fenotypy společně definovanými jako srdeční kanálopatie je častěji autozomálně dominantní. V této souvislosti postačuje pro stanovení nebo vyloučení kauzality genetické testování obou rodičů a kdykoli je to možné, i prvostupňových příbuzných postižených nebo neovlivněných fenotypem. I když méně časté, lze také pozorovat sporadické případy. V takových případech by patogenní genetická varianta neměla být u rodičů detekována, ale pro potvrzení sporadického vzoru je nutné jejich testování. V těchto případech by sourozenci a/nebo příbuzní prvního stupně měli být testováni pouze v nepřítomnosti rodičů.

Jedná se o pilotní studii, která poskytne informace o populaci postižené těmito nemocemi u nás. Všichni způsobilí pacienti, postižení kanálopatiemi a sledováni v nemocnicích a klinikách patřících Rede D'Or São Luiz v Rio de Janeiru a vybraní rodinní příslušníci, budou pozváni k účasti na studii. Sekvenování DNA bude provedeno 3 ± 2 měsíce po zařazení. Fenotypová analýza bude provedena 2 ± 1 měsíc po zařazení a bude sestávat z klinického hodnocení, echokardiografie, 24hodinového Holterova nebo prodlouženého elektrokardiografického monitorování (formulář pro sběr dat – příloha B). Bude provedena kompletní a integrovaná analýza genotyp-fenotyp zahrnutých případů. Pacienti a jejich rodiny budou sledováni po dobu minimálně 2 let a maximálně 5 let a budou každoročně hodnoceni klinickými konzultacemi a stejnými doplňkovými metodami popsanými výše.

POSTUPY Odběr a purifikace vzorků DNA Genomová DNA bude purifikována z periferní krve nebo ústních výtěrů. Plná krev bude odebrána periferní flebotomií do zkumavek obsahujících K2EDTA jako antikoagulant. Vzorky krve budou před purifikací DNA skladovány při 4-8 oC po dobu až jednoho týdne. Ústní výtěry budou odebrány pomocí • DNA soupravy ORAcollect (OCR-100) (DNA Genotek Inc., Kanada). Genomická DNA ze vzorků plné krve nebo ústních výtěrů bude purifikována pomocí DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN).

Analýza zárodečných genetických variant (zděděných nebo de novo) prostřednictvím sekvenování DNA, ať už Sangerovou metodou nebo sekvenováním nové generace, není ovlivněna tkání nebo tělesnou tekutinou, ze které je DNA purifikována. Proto lze periferní krev nebo ústní nátěry/sliny použít jako zdroj DNA bez jakéhokoli technického kompromisu nebo zavedení zkreslení. Výběr krve nebo ústního výtěru bude tedy v podstatě určován pohodlím a komfortem pro účastníka výzkumu a zaměřením na racionální využití dostupných zdrojů.

Kvantifikace DNA a kontrola kvality Purifikovaná genomová DNA bude kvantifikována ultrafialovou spektrofotometrií pomocí mikroobjemového spektrofotometru NanoDrop (ThermoFisher Scientific). Integrita DNA bude měřena elektroforézou na agarózovém gelu a pomocí systému Agilent 4200 TapeStation.

Strategie genetické analýzy V počáteční fázi objevování bude vybráno 20 probandů pro analýzu sekvencí a variant počtu kopií v rámci panelu vybraných kandidátních genů. Podezřelé kauzální proměnné identifikované v této počáteční fázi budou později analyzovány až u 4 rodinných příslušníků nebo příbuzných prvního stupně u každého probanda.

Genetický panel a kritéria výběru genů Kandidátské geny zahrnuté do panelu byly vybrány z vyhledávání v databázi Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) na základě přezkoumání literatury a konsenzu, doporučení a pokynů vydaných panely a odbornými společnostmi. Konečný seznam kandidátních genů byl stanoven tak, aby zahrnoval klinicky informativní geny, tj. které pomáhají při diagnostických nebo terapeutických rozhodnutích, a experimentální důkazy svědčící o genetickém zapojení do patofyziologie arytmií.

Sekvenování nové generace Kandidátské geny budou analyzovány pro detekci sekvencí a variant počtu kopií pomocí sekvenování nové generace. Celá kódující oblast a hranice intron-exon budou sekvenovány pomocí technologie Ampliseq™. Oligonukleotidy pro amplifikaci oblastí zájmu budou navrženy pomocí online nástroje Ion AmpliSeq Designer. Knihovny sekvenování budou generovány pomocí sady Ion AmpliSeq™ Library Kit na systému Ion OneTouch 2 (ThermoFisher Scientific). Sekvenování bude provedeno na sekvenátoru Ion Personal Genome Machine (PGM) pomocí Ion 318™ Chip v2 BC a sekvenačních činidel Ion PGM™ Hi-Q™ View (ThermoFisher Scientific). Sekvenační analýza bude provedena pomocí softwaru Ion Reporter™ (ThermoFisher Scientific).

Interpretace a reportování sekvenčních variant. Interpretace a registrace sekvenčních variant bude provedena podle konsensuálního doporučení Americké vysoké školy lékařské genetiky a genomiky, Asociace pro molekulární patologii a College of American Pathologists. Stručně řečeno, k popisu variant identifikovaných v genech, které způsobují mendelovské poruchy, tento konsenzus doporučuje použití standardních termínů: patogenní, pravděpodobně patogenní, nejistý význam, pravděpodobně benigní a benigní. Podle tohoto doporučení je proces klasifikace variant v těchto pěti kategoriích založen na řadě různých typů důkazů, jako jsou populační data, počítačové simulace, funkční data a data genetické segregace.

Vyhodnocení patogenity detekovaných genetických variant bude provedeno nezávisle, tedy „naslepo“, odborníky. Klinické hodnocení pacientů a stanovení fenotypu provedou odborníci na arytmii ve skupině pod dohledem Dr. Nilsona Araújo. Genetické hodnocení provede „naslepo“ Dr. Marcelo Reis. V případě divergence mezi nalezenou variantou a fenotypem budou nálezy přezkoumány Dr. Lucianou Sacilotto (specialistka na arytmii se zkušenostmi v klinické genetice) a Dr. Carolina Bustamante (specialistka na molekulární genetiku).

Výpočetní predikce funkčního účinku genetických variant K odhadu funkčních účinků sekvenčních variant bude použita řada veřejně dostupných nástrojů. Tyto algoritmy berou v úvahu evoluční konzervaci aminokyselinových zbytků a konzervovaných proteinových domén, proteinovou strukturu a funkci, Hiden Markovovy modely a logiku závislou na poloze. Kdykoli budou k dispozici, budou pro interpretaci zvažována také funkční experimentální data in vitro o účinku specifických sekvenčních variant.