唾液中のストレプトコッカスミュータンスと pH レベルに対するモラスアルバ果実エキスとクロルヘキシジンの有効性

はじめに Streptococcus mutans は、虫歯の発生に関与する主要な病原体です。 これは嫌気性のグラム陽性球菌であり、口腔微生物叢に自然に存在し、歯の表面に容易に定着し、細胞外多糖類を組み合わせて酸の産生を開始し、歯の脱灰と虫歯の発生を引き起こします (Shah et al., 2018)。 . 定着した表面の量は、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスに関連しています。 したがって、口腔内のストレプトコッカス・ミュータンスの濃度を低下させることにより、齲蝕原性微生物の発生を減少させる上で大きな利点が得られるでしょう。 (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas and Drake., 2018) 齲蝕は、口腔内の無機物質の脱灰と有機物質の溶解によって同定される口腔の微生物疾患です。歯。 う蝕は歴史を通じて認識されており、世界中に存在し、44% と報告されていますが、国によって重症度と有病率が異なります (J.V Soames and J.C Southam et al., 2018)。 私たちの近隣諸国では、虫歯の頻度は非常に高く、中国、イラン、インドではそれぞれ 68%、65%、64% であると記録されています。 パキスタンでの齲蝕の有病率も非常に高く、約 62% であり、重大な罹患率と経済的影響に関連しています (Reddy KS, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013)。歯の構造、歯の表面に形成された糖とバイオフィルム (Pitts, N. B et al., 2016)。 齲蝕プロセスは、歯の脱灰と再石灰化の期間の変化から成り、正味の脱灰が適切な時間にわたって起こると、齲蝕の開始につながります。 虫歯の原因は、口腔細菌による糖の発酵によって生成される乳酸です (Banas and Drake., 2018)。 唾液の正常な pH レベルは 6.2 ～ 7.6 です。 中性pHでは、唾液からのカルシウムおよびリン酸イオンがエナメル質に取り込まれ、エナメル質の構造を維持しますが、pHレベルが通常よりも低い、つまり5.5または5.5未満になると、エナメル質からのカルシウムおよびリン酸イオンが浸出して原因となります.エナメル質のヒドロキシアパタイト結晶からプラークへのミネラルイオンの交換により、歯の脱灰が起こります (J.V Soames Oral pathology 2018)。

齲蝕管理では、食習慣の変更、細菌の増殖の変更または抑制、唾液の pH レベルおよび緩衝能力の変更によって歯の脱灰を減らすことが重視されます (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018)。 さまざまな抗菌性合成うがい薬、歯磨き粉、ゲル、チューインガム、ワニスが、う蝕原性微生物を狙って口の衛生状態を改善し、虫歯を予防するために使用されてきました。 むし歯の予防は、食後の口内ブラッシング、フッ化物練り歯磨き、抗菌うがい薬、歯間清掃補助剤、唾液刺激剤（キシリトール、マンニトール）、小窩裂溝シーラント、および歯の表面への局所的なフッ化物の適用によって行われます. マウスリンスはまた、歯肉の炎症を軽減し、歯垢の形成を抑制します (Velmurugan et al., 2013, Chen and Wang, 2010, Zajkani et al., 2018)。 うがい薬には抗う蝕効果がありますが、いくつかの欠点もあります。 それらは費用がかかり、歯の着色や口腔内の灼熱感などの副作用があります (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018)。

クロルヘキシジンは、プラークの蓄積を減らすためのゴールドスタンダードであり、一般的に使用され、最も効果的な化学的アプローチです. クロルヘキシジン (0.2%) で毎日口をすすぐと、口腔内のミュータンス連鎖球菌の増殖速度が低下することが示されています (Velmurugan et al., 2013)。 ただし、口腔粘膜の侵食、耳下腺の腫れ、歯の着色、灼熱感、苦味などの副作用があります。 (Jacob and Nivedhitha, 2018b, Shah et al., 2018, Van der Weijden et al., 2010, Nayak et al., 2012, Solderer et al., 2019) 多くの人々が、さまざまな病気の伝統的な治療法または代替治療法として薬用植物を使用しています。安全性プロファイルが向上し、健康に有益な効果があり、コストが低く、入手しやすいためです。 薬用に使用される植物種の中には、Morus 属の植物種があり、最も一般的に使用される種は Morus alba、rubra、nigra であり、さまざまな生命を脅かす感染症に対する抗菌特性も示しています (Ercisli S et al., 2006)。 クワは一般に白桑と呼ばれ、クワ科に属し、ツタンカーメン、シャートゥート、クワとも呼ばれます。 Morus Alba (白い桑) は、中国、インド、パキスタン、日本が原産です (Kumar V et al., 2008)。 現在の研究では、Morus alba 果実抽出物は、その抗菌特性により、口腔病原体に対するクロルヘキシジンと Streptococcus mutans と比較されます。

問題の説明 齲蝕は、パキスタンを含む世界中で非常に蔓延しています。歯の喪失、不正咬合、および顎関節の問題を引き起こします。 関連する感染症は、表在性および深部の筋膜腔に広がるリスクを伴う可能性があり、生命を脅かす感染症を引き起こす可能性さえあります. 齲蝕の治療は非常に高価であり、すでに恵まれない社会経済人口の少ない私たちに経済的負担をもたらします。 そのため、虫歯の活動を減らすための抗菌効果やその他の有益な効果があり、安全性が高く、簡単に入手でき、費用対効果の高い天然物を探索する必要があります.

研究課題 Morus alba 果実の水性抽出物は、虫歯予防のためにクロルヘキシジンうがい薬と同等に効果的ですか? 目的 唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス数の減少に基づいて、齲蝕患者におけるクワ果実抽出物とクロルヘキシジンの有効性を比較すること。

唾液pHレベルの上昇に基づいて、齲蝕患者におけるクワ果実抽出物とクロルヘキシジンの有効性を比較すること。

理論的根拠 クロルヘキシジンは化学物質であり、苦味があり、口腔内に灼熱感を引き起こし、美容上の理由から患者には適さない場合があります。 口腔病原体に対する抗菌活性を有するハーブ製品由来のうがい薬は、私たちの臨床設備における虫歯の負担を軽減するための経済的で安全な治療オプションを提供する可能性があります. 私たちの知る限りでは、桑の実抽出物は、ストレプトコッカス・ミュータンスを含む口腔病原体に対する抗菌活性について評価されていません.

仮説

帰無仮説：

Ho: Morus alba 果実の水性抽出物は、齲歯予防のためのクロルヘキシジンうがい薬と同等に効果的ではありません.

別の仮説:

Ha: Morus alba 果実の水性抽出物は、虫歯予防のためのクロルヘキシジン洗口液と同等の効果があります。

文献のレビュー 齲蝕は、歯の構造、糖、および歯の表面の微生物バイオフィルムの間の接続で構成されます (Pitts, N. B et al., 2016)。 Streptococcus mutans と唾液の pH は、虫歯を引き起こす 2 つの主な要因であるため、これらを標的とすることは、この世界的な疾患に取り組むための効率的な方法となる可能性があります。 クロルヘキシジンは優れた抗菌剤であり、口腔の健康と衛生を維持するための恩恵と考えられています. 同様に、クロルヘキシジンと同じくらい効果的な多くのハーブ剤が導入されています. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob and Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017)簡単に入手でき、安全で費用対効果が高い。 クワ種には薬効もあり、抗糖尿病薬、神経保護薬、脂質低下薬、下剤として使用されてきました (Anna Gryn-Rynko et al., 2016)。 100 種以上のクワが世界中に存在し、パキスタンでは 25 種のクワが利用可能です。 最も一般的なクワの種は、クワ、ルブラ、ニグラです (Imran M., Khan H., et al., 2010)。

クワの実には、フラボノール、ポリフェノール、アルカロイド、多糖類などの多くの活性物質が含まれています (Gundogdu M et al., 2011)。 クワは、ビタミン A、ビタミン B1、葉酸、ビタミン C、ミネラル、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、アントシアニン、サポニンの豊富な供給源です (Jiang Y et al., 2015)。

従来の中国の自然療法では、桑の実は糖尿病、高血圧、貧血、関節痛を治療する人々の薬に利用されてきました. クワは、その抗糖尿病、駆虫、抗菌、抗不安、肝保護および腎保護特性で知られています (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ）。 クワの実は、同じ種からのものですが、異なる抗酸化特性と異なる化学組成を含んでいる可能性があります. クワのミネラル要素には、カリウム (K)、ナトリウム (Na)、リン (P)、カルシウム (Ca)、亜鉛 (Zn)、鉄 (Fe)、銅 (Cu)、マンガン (Mn)、セレン (Se) が含まれます。 )、マグネシウム (Mg)、クロム (Cr)、ヒ素 (As) (Liang, L et al., 2012)。

クワの樹皮のメタノール抽出物とその成分は、抗菌剤として使用されます (Kuete, et al., 2009)。 クワノンＧの根皮から得られる抗菌剤「クワノンＧ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに対してＭＩＣ８．０μｇ／ｍｌで活性を示した。 クワノン G の殺菌試験では、20 μg/ml の濃度で 60 秒でストレプトコッカス ミュータンスを完全に不活化することが示されました (Park, K. M et al., 2002)。

Jha らによると、彼はグラム陽性菌 (黄色ブドウ球菌、枯草菌)、およびグラム陰性菌 (緑膿菌および大腸菌) に対するクワの葉 (水性抽出物) の抗菌活性を評価しました。 抗菌活性の結果は、枯草菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、および大腸菌が、粗抽出物に対して最も感受性の高い細菌種であり、0.2～26 mg/mL の濃度で MIC 値を示したことを確認しました (S. Jha、AKら、2013）。

1-デオキシノジルマイシン (クワの葉の成分) とクワの葉の粗エタノール抽出物の抗菌活性を評価しました。 1-デオキシノジルマイシンおよびクワの葉（粗抽出物）はいずれもストレプトコッカス・ミュータンスに対して強い静菌活性を示したが、1-デオキシノジルマイシンはクワの粗抽出物（125mg/mg/mL）よりも低いMIC値（15.6mg/ml）を示した。 (B. イスラム、他 2008)。 クワの葉のエタノール抽出物は、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ クルセイ、カンジダ アルビカンス、アスペルギルス フラバス、およびカンジダ トロピカリスに対して抗菌活性を示しました (Oliveira et al., 2015)。

アントシアニンは、Morus alba 果実の最も重要な成分であり、抗菌、抗酸化、神経保護、および抗炎症特性などの多くの生物活性に関与するフェノール化合物です (Liu LK et al., 2008)。 シアニジン-3-グルコシドとシアニジン-3-ルチノシドは、桑の実から分離された主要なアントシアニンです (Suh H.J et al 2003, Liu X. et al 2004)。 クワ属アルバの有効成分はアントシアニンであり、クワ属種の果実に存在するアントシアニンは、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を示しました (Chen H., et al 2017)。 アントシアニンが抗菌効果を生み出す提案されたメカニズムには、病原体の細胞膜に対する作用と、その核酸とタンパク質の漏出が含まれます (Bajpai et al., 2013)。 アントシアニンは、微生物のスーパーオキシドジスムターゼ、アルカリホスファターゼ、および ATP 産生を阻害し、続いて TCA サイクルを阻害します (Li et al., 2010)。これらすべてのメカニズムにより、病原細胞が溶解します。

Shumaila Naz らは、水系微生物病原体 (Listeria monocytogene、Salmonella enteric、Moraxella catarrhalis、Legionella pneumophila、Micrococcus luteus、Proteus mirabilis、Clostridium sp.、Serratia sp.、Aeromonas Hydrophila、Corneybacterium sp.) に対する桑の実抽出物の抗菌活性を確認しました。 .、枯草菌、大腸菌、メガテリウム菌、バチルス チューリンゲンシス、化膿連鎖球菌、放線菌種、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、チフス菌、炭疽菌、肺炎連鎖球菌) が異なる水サンプルから分離されました。 その結果、桑の実の抽出物が水系の微生物病原体に対して有効であることが示されました (Shumaila Naz et al., 2018)。

MORUS ALBA の安全性プロファイル ラットに 1gm/kg の最大用量で 7 日間、Morus alba 抽出物を胃内投与しても、毒性作用は生じませんでした (Jiao Y et al., 2017)。 ラットで実施された研究では、2 週間の投与で 250mg/kg の用量でラットにクワのエタノール抽出物の効果が毒性効果を引き起こさなかった (Hwang et al., 2016)。 桑の実由来のアントシアニンを与えられたラットで行われた別の研究. アントシアニンは、ラットのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) およびアラニンアミノトランスフェラーゼ ALT の上昇レベルを低下させました。 (肝保護効果) サンプルサイズの計算 サンプルサイズは、以下の統計を考慮して、Open Epi サンプルサイズ計算機を使用して推定されました。 pH レベル (クロルヘキシジン) の変化 = 6.88±0.20 (Velmurugan et al., 2013) であり、クワ抽出物の pH の 20% の差を 8.256±0.24 と考える 検定力= 90% 信頼水準= 95% 計算されたサンプル サイズは、各グループで 1 でした。 ただし、正規性の仮定に従って、各グループに 40 人の患者を持つ 120 人の患者を含めます。

研究方法論 研究環境 この研究は、ラズベラ地区の市民病院ウタールの歯科部門と、ラズベラ農業、水および海洋科学大学 (LUAWMS) バロチスタンの植物病理学部門で実施されます。

研究デザイン 無作為化対照臨床試験 これは二重盲検研究であり、研究者と患者の両方が結果に偏りがないように盲検化されます。 ただし、共同研究者は、患者がゴールド スタンダードまたはハーブのマウスウォッシュを受けていることを知っています。

研究期間 研究期間は、ジオーディン大学の RAC、ERC、および BASR からの研究の承認後、6 か月から 1 年間です。

サンプリング手法 非確率連続サンプリング手法がサンプル選択に使用されます

選択基準 包含基準 年齢 18 ～ 40 歳のすべての患者 口内に少なくとも 20 本の歯があり、親知らずは含まれません。

どちらの性別の患者。 活動性および未治療の齲蝕病変を有する患者（少なくとも1本の齲蝕歯が患者の口腔内に存在する必要があります）。

除外基準 矯正治療中の患者 すでに抗生物質療法または抗菌リンスを受けている患者。 クロルヘキシジンうがい薬にアレルギーのある患者 同意が得られなかった患者 材料と方法 研究に使用された材料 研究に使用された材料は、クロルヘキシジンうがい薬、Morus alba の果実、pH メーター、選択寒天、ストレプトコッカス ミュータンスの培養プレート、テストチューブと唾液採取キット。

MORUS ALBA COLLECTION Morus alba (White Mulberry) の果実は本物のハーブ店から入手し、クワの果実は LUAWMS の植物部門から認証されます。

MORUS ALBA FRUIT の水性抽出物の調製 調製は、植物病理学 LUAWMS 部門で行われます。 クワの実を蒸留水で洗浄し、乾燥させます。 次に、果物の材料（Morus alba）を乳鉢と乳棒で粉砕します。 20% 水性製剤の場合、100ml の蒸留水を 20g の粉砕粉末に加え、振盪インキュベーターで 8 時間インキュベートします。 (30%水性製剤の場合、粉砕粉末30gに蒸留水100mlを加えます)。 水性抽出物は、Watman No. 1 (Schuell and Schleicher 125 mm Cat No. 1001 125) ろ紙 (Shumaila naz et al., 2018) でろ過されます。

参加者の標準化 選択基準に従って選択された被験者は標準化されます。 参加者は、1日2回（朝の朝食後と就寝時）に歯を磨き、ジャンクフードを避けるようにアドバイスされます. 参加者は、砂糖の入った飲み物 (お茶、コーヒー、甘い飲み物) を 1 日 2 回まで飲むことをお勧めします。 これらの指示は、書面でも参加者に提供されます。 参加者はこのガイダンスに従って行動するように指示され、ベースラインの唾液サンプルのために 1 週​​間後に呼び出されます。

データ収集手順 選択基準を満たす合計 120 人の患者が研究に登録されます。 すべての参加者からインフォームド コンセントが取得されます。 同意を得ている間、患者はゴールドスタンダード（クロルヘキシジン）またはハーブマウスウォッシュのいずれかを受け取ることを知らされます. グループA、B、またはCのいずれかの患者の選択は、乱数表法によって行われます。 A、B、および C としてのグループのラベル付けは、共同研究者によって行われます。 グループのリストは不透明な封筒に封印され、調査が完了すると開封されます。

研究グループ 合計 120 人の参加者が研究に含まれます。 参加者は 3 つのグループ (グループ A、B、C) に均等に分けられます。 グループAの参加者にはクロルヘキシジンのうがい薬が与えられ、グループBとCの参加者にはクワの実の20％と30％の水性抽出物がそれぞれ与えられます.

唾液ｐＨ分析 唾液ｐＨレベル分析は、ｐＨメーターを使用して行い、唾液ｐＨは、ベースライン時およびそれぞれのマウスウォッシュの使用後１５日目に記録する。

実験手順 5 ml のベースライン非刺激唾液サンプルは、受動的垂下法によって参加者から採取され、3 ml は唾液 pH の測定に使用され、残りの唾液サンプルは 0 C で保存されます。ストレプトコッカス・ミュータンスの評価。 ベースラインの唾液サンプルを採取した後、参加者はそれぞれのうがい薬 10ml をすすぎ、吐き出す前に 30 秒間口の中で保持するよう求められます。 この手順は、参加者によって 1 日 2 回、15 日間繰り返されます。 15日後、参加者から唾液サンプルを再度採取してミュータンス連鎖球菌の評価を行い、得られた結果をミュータンス連鎖球菌のベースライン唾液サンプルと比較します。

培養手順 微生物含有量を評価するための技術は、希釈平板培養法です。 唾液微生物分析は、各唾液サンプルを蒸留水で 1:10 の比率で希釈することによって行われます。 次いで、各サンプルをミティス・サリバリウス寒天培地（ＭＳＡ）を有するプレートにストリークする。 次いで、プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、ストレプトコッカス・ミュータンスのコロニー（ＣＦＵ）の数を自己照明双眼顕微鏡下で計数する。 すべての調査結果は、事前に設計されたプロフォーマに記録されます。 (Smariti sexena et al. 2017年、ベルムルガンら。 2013, Hongkun Wu et al., 2003) 統計分析 データは SPSS バージョン 23 を使用して分析されます。 数値データの平均と標準偏差が取得されます。 頻度とパーセンテージは、カテゴリ データに適用されます。

対応のある t 検定は、各グループの細菌数と pH 値の介入前後の値を比較するために行われ、3 つのグループ間の比較には事後テューキー検定による ANOVA が適用されます。 P < 0.05 は、統計的に有意と見なされます。

倫理的配慮 倫理的承認は、ジオーディン大学の倫理委員会から取得されます。 測定を記録する前に、各被験者からインフォームド コンセントを取得します。 研究から収集されたすべての情報は、極秘に保管されます。 すべての被験者の匿名性は、情報を慎重に保管することによって維持されます。 歯科関連の問題に気づいた場合は、患者に通知し、必要な治療のために関連する診療所に紹介します。

研究の意義 私たちの研究の結果、Morus alba がより効果的であることが証明されれば、天然資源に由来する、安全で低コストで環境に優しい虫歯予防剤が将来利用できるようになるでしょう。 Morus alba は、子供や、刺激、味の変化、灼熱感、および美容上の理由で合成マウスウォッシュを使用できない人にも使用できます.

クワは他のハーブ製品と同様に環境にやさしく、抗菌性口腔リンスとしての処方は、現在虫歯のゴールドスタンダード薬剤である化学的に製造された口腔リンスのクロルヘキシジンによって生じる環境への毒性影響を最小限に抑えるのに役立ちます. この研究の結果は、抗菌の可能性のために伝統的に使用されてきた他のハーブ製品に関する他の研究への扉を開くかもしれません.