EFFICACITÉ DES EXTRAITS DE FRUITS DE MORUS ALBA ET DE LA CHLORHEXIDINE SUR LES STREPTOCOCCUS MUTANS SALIVAIRES ET LES NIVEAUX DE pH

INTRODUCTION Streptococcus mutans est le principal agent pathogène impliqué dans le développement des caries dentaires. Il s'agit d'un coccus gram positif anaérobie, naturellement présent dans le microbiote buccal et qui peut facilement coloniser la surface de la dent et initier la production d'acide en combinant un polysaccharide extracellulaire qui entraîne une déminéralisation de la dent et le développement de caries dentaires (Shah et al., 2018) . La quantité de surfaces colonisées est associée à des streptocoques mutans dans la salive. Ainsi, en diminuant la concentration de Streptococcus mutans dans la cavité buccale aurait un avantage significatif dans la réduction de l'apparition de microbes cariogènes. (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas et Drake., 2018) La carie dentaire est une maladie microbienne de la cavité buccale, identifiée par la déminéralisation des substances inorganiques et la dissolution des substances organiques de la dents. La carie dentaire a été reconnue à travers l'histoire et existe dans le monde entier, rapportée à 44%, mais la gravité et la prévalence changent dans différents pays (J.V Soames et J.C Southam et al., 2018). Dans nos pays voisins, la fréquence des caries dentaires est assez élevée, documentée à 68%, 65% et 64% en Chine, en Iran et en Inde respectivement. La prévalence de la carie dentaire au Pakistan est également assez élevée, autour de 62 %, ce qui est associé à une morbidité importante et à des conséquences économiques (Reddy K S, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013). La carie dentaire implique essentiellement un contact entre le la structure dentaire, les sucres et le biofilm formés sur les surfaces dentaires (Pitts, N. B et al., 2016). Le processus carieux composé de périodes altérées de déminéralisation et de reminéralisation de la dent, qui, si la déminéralisation nette se produit sur une durée adéquate, entraîne l'initiation de la carie dentaire. La cause des caries dentaires est l'acide lactique produit par la fermentation des sucres par les bactéries buccales (Banas et Drake., 2018). Le pH normal de la salive est de 6,2 à 7,6. À pH neutre, les ions calcium et phosphate de la salive s'incorporent à l'émail et maintiennent la structure de l'émail, mais lorsque le niveau de pH tombe en dessous de la normale, c'est-à-dire à 5,5 ou en dessous de 5,5, les ions calcium et phosphate de l'émail sont lessivés et provoquent l'échange d'ions minéraux des cristaux d'hydroxyapatite de l'émail vers la plaque, entraînant une déminéralisation de la dent (J.V Soames Oral pathology 2018).

La gestion des caries dentaires met l'accent sur la réduction de la déminéralisation des dents en modifiant les habitudes alimentaires, en modifiant ou en inhibant la croissance bactérienne, en modifiant le niveau de pH salivaire et la capacité tampon (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018). Différents bains de bouche synthétiques antimicrobiens, dentifrices, gels, gommes à mâcher et vernis ont été utilisés pour améliorer l'hygiène buccale et prévenir les caries dentaires en ciblant les micro-organismes cariogènes. La prévention des caries dentaires se fait par le brossage de la bouche après les repas, en utilisant des dentifrices fluorés, des bains de bouche antimicrobiens, des aides au nettoyage interdentaire, des stimulants salivaires (xylitol, mannitol), des scellants pour puits et fissures et l'application de fluorure topique sur les surfaces des dents. Les bains de bouche réduisent également l'inflammation gingivale et inhibent la formation de plaque (Velmurugan et al., 2013, Chen et Wang, 2010, Zajkani et al., 2018). Les bains de bouche ont des effets anticariogènes, mais présentent certains inconvénients. Ils sont coûteux, ont des effets secondaires tels que coloration des dents et sensation de brûlure dans la cavité buccale (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018).

La chlorhexidine est l'approche chimique de référence, couramment utilisée et la plus efficace pour réduire l'accumulation de plaque. Il a été démontré que le rinçage quotidien de la bouche avec de la chlorhexidine (0,2 %) réduit le taux de croissance des streptocoques mutans dans la cavité buccale (Velmurugan et al., 2013). Cependant, il a certains effets secondaires, à savoir une érosion de la muqueuse buccale, un gonflement de la parotide, une coloration des dents, une sensation de brûlure et un goût amer. (Jacob et Nivedhitha, 2018b, Shah et al., 2018, Van der Weijden et al., 2010, Nayak et al., 2012, Solderer et al., 2019) De nombreuses populations utilisent les plantes médicinales comme traitements traditionnels ou alternatifs pour diverses affections en raison de leurs meilleurs profils de sécurité, de leurs effets bénéfiques sur la santé, de leur coût réduit et de leur disponibilité facile. Parmi les espèces végétales utilisées à des fins médicinales figurent celles du genre Morus, dont les espèces les plus couramment utilisées sont Morus alba, rubra et nigra, qui ont également montré des propriétés antimicrobiennes contre diverses infections potentiellement mortelles (Ercisli S et al., 2006). Morus alba communément appelé mûrier blanc, et il appartient à la famille des Moracées est autrement appelé Tut, shahtoot ou mûrier. Morus Alba (mûrier blanc) est originaire de Chine, d'Inde, du Pakistan et du Japon (Kumar V et al., 2008). Dans la présente étude, l'extrait de fruit de Morus alba sera comparé à la chlorhexidine de Streptococcus mutans contre les agents pathogènes oraux en raison de ses propriétés antimicrobiennes.

Énoncé du problème Les caries dentaires sont très répandues dans le monde entier, y compris au Pakistan ; il provoque une perte de dents, une malocclusion et des problèmes d'articulation temporo-mandibulaire. Les infections associées peuvent comporter un risque de propagation dans les espaces fasciaux superficiels et profonds et peuvent même provoquer des infections potentiellement mortelles. Le traitement des caries dentaires est assez coûteux et constitue un fardeau économique pour notre population socio-économique défavorisée déjà défavorisée. Ainsi, il est nécessaire d'explorer des produits naturels qui peuvent avoir des effets antimicrobiens et d'autres effets bénéfiques pour diminuer l'activité carieuse ainsi que de bons profils de sécurité, facilement disponibles et rentables.

Question de recherche Les extraits aqueux du fruit de Morus alba sont-ils aussi efficaces que les bains de bouche à la chlorhexidine pour la prévention des caries dentaires ? Objectifs Comparer l'efficacité des extraits de fruits de Morus alba avec la chlorhexidine chez les patients ayant des caries dentaires sur la base de la réduction du nombre de Streptococcus mutans dans leur salive.

Comparer l'efficacité des extraits de fruits de Morus alba avec la chlorhexidine chez les patients ayant des caries dentaires sur la base de l'augmentation de leurs niveaux de pH salivaire.

Justification La chlorhexidine est un produit chimique, ayant un goût amer et provoquant une sensation de brûlure dans la cavité buccale et peut ne pas être faisable pour les patients pour des raisons esthétiques. Les bains de bouche dérivés de produits à base de plantes, ayant une activité antimicrobienne contre les agents pathogènes buccaux, pourraient constituer une option de traitement économique et sûre pour réduire le fardeau des caries dentaires dans notre configuration clinique. À notre connaissance, l'extrait de mûrier n'a pas été évalué pour son activité antimicrobienne contre les agents pathogènes oraux, y compris Streptococcus mutans.

Hypothèse

Hypothèse nulle:

Ho : Les extraits aqueux du fruit de Morus alba ne sont pas aussi efficaces que les bains de bouche à la chlorhexidine pour la prévention des caries dentaires.

Hypothèse alternative :

Ha : Les extraits aqueux du fruit de Morus alba sont aussi efficaces que les bains de bouche à la chlorhexidine pour la prévention des caries dentaires.

REVUE DE LA LITTÉRATURE La carie dentaire consiste en des connexions entre les structures dentaires, les sucres et le biofilm microbien à la surface des dents (Pitts, N. B et al., 2016). Streptococcus mutans et le pH salivaire sont les deux principaux facteurs qui causent les caries dentaires et donc les cibler peut être une voie efficace pour lutter contre cette maladie mondiale. La chlorhexidine est un excellent agent antimicrobien et considérée comme une aubaine pour le maintien de la santé et de l'hygiène bucco-dentaire. De même, de nombreux agents à base de plantes ont été introduits qui sont aussi efficaces que la chlorhexidine. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob et Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017) Les plantes médicinales ont été utilisées par de nombreuses populations comme agent thérapeutique en raison de leur disponibilité facile, sécurité et rentabilité. Les espèces de morus ont également des propriétés médicinales et ont été utilisées comme antidiabétiques, neuroprotecteurs, hypolipidémiants et comme laxatifs (Anna Gryn-Rynko et al., 2016). Plus de 100 espèces de morus sont présentes dans le monde entier et au Pakistan, il existe 25 espèces de morus disponibles. Les espèces de morus les plus courantes sont Morus alba, rubra et nigra (Imran M., Khan H., et al., 2010).

Le fruit de Morus alba contient de nombreuses substances actives, telles que des flavonols, des polyphénols, des alcaloïdes et des polysaccharides (Gundogdu M et al., 2011). Morus alba est la riche source de vitamine A, vitamine B1, acide folique, vitamine C, minéraux, glucides, acides aminés, acides gras, anthocyanes et saponines (Jiang Y et al., 2015).

Dans les médecines naturelles chinoises conventionnelles, les fruits du mûrier ont été utilisés dans des médicaments pour traiter le diabète, l'hypertension, l'anémie et les douleurs articulaires. Morus alba est connu pour ses propriétés antidiabétiques, antihelminthiques, antimicrobiennes, anxiolytiques, hépatoprotectrices et néphroprotectrices (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ). Le fruit Morus, bien qu'appartenant à la même espèce, peut contenir des propriétés antioxydantes différentes ainsi qu'une composition chimique différente. Les éléments minéraux de Morus alba comprennent le potassium (K), le sodium (Na), le phosphore (P), le calcium (Ca), le zinc (Zn), le fer (Fe), le cuivre (Cu), le manganèse (Mn), le sélénium (Se ), magnésium (Mg), chrome (Cr) et arsenic (As) (Liang, L et al., 2012).

L'extrait méthanolique de l'écorce de Morus alba et ses constituants sont utilisés comme agents antimicrobiens (Kuete, et al., 2009). L'agent antimicrobien "kuwanon G" obtenu à partir de l'écorce de la racine de Morus alba a indiqué une activité contre Streptococcus mutans à une CMI de 8,0 μg/ml. Le test bactéricide du kuwanon G a indiqué qu'il inactivait totalement Streptococcus mutans à la concentration de 20 μg/ml en 60 secondes (Park, K. M et al., 2002).

Selon Jha et al, il a évalué l'activité antimicrobienne des feuilles de Morus alba (extrait aqueux) sur les bactéries gram positives (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) et gram négatives (Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli). Les résultats de l'activité antimicrobienne ont confirmé que Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Escherichia coli étaient les espèces bactériennes les plus sensibles à l'extrait brut, ont montré la valeur MIC à une concentration de 0,2 à 26 mg/mL (S. Jha, A.K et al., 2013).

L'activité antimicrobienne de la 1-désoxynojirmiycine (composant des feuilles de Morus alba) et de l'extrait éthanolique brut de feuilles de Morus alba a été évaluée. Les feuilles de 1-désoxynojirmiycine et de morus alba (extrait brut) ont montré une forte activité bactériostatique contre Streptococcus mutans, mais la 1-désoxynojirmiycine a montré une valeur CMI inférieure (15,6 mg/ml) à celle de l'extrait brut de Morus alba (125 mg/mg/mL) (B. Islam., et al 2008). L'extrait éthanolique de feuilles de Morus alba a montré une activité antimicrobienne contre Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida krusei, Candida albicans, Aspergillus flavus et Candida tropicalis (Oliveira et al., 2015).

Les anthocyanes sont le constituant le plus important du fruit de Morus alba, qui sont des composés phénoliques responsables de nombreuses activités biologiques telles que les propriétés antimicrobiennes, antioxydantes, neuroprotectrices et anti-inflammatoires (Liu LK et al., 2008). Le cyanidine-3-glucoside et le cyanidine-3-rutinoside sont les principales anthocyanes séparées du fruit du mûrier (Suh H.J et al 2003, Liu X.et al 2004). L'ingrédient actif de Morus alba est l'anthocyanine et l'anthocyanine présente dans le fruit des espèces de Morus a montré des activités antibactériennes contre E. coli, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus (Chen H., et al 2017). Les mécanismes proposés par lesquels l'anthocyanine produit des effets antimicrobiens comprennent une action sur la membrane cellulaire de l'agent pathogène avec la fuite de son acide nucléique et de ses protéines (Bajpai et al., 2013). L'anthocyanine provoque l'inhibition de la production microbienne de superoxyde dismutase, de phosphatase alcaline et d'ATP avec inhibition subséquente du cycle TCA (Li et al., 2010). Tous ces mécanismes entraînent la lyse des cellules pathogènes.

Shumaila Naz et al ont confirmé l'activité antimicrobienne des extraits de fruits de mûrier contre les agents pathogènes microbiens d'origine hydrique (Listeria monocytogene, Salmonella enteric, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Clostridium sp., Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Corneybacterium sp. ., Bacillus subtilis, , E. coli, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptococcus pyogenes, Actinomyces sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhi, Bacillus anthracis et Streptococcus pneumonia) isolés de différents échantillons d'eau. Les résultats ont indiqué que les extraits de mûrier sont efficaces contre les agents pathogènes microbiens d'origine hydrique (Shumaila Naz et al., 2018).

PROFILS DE SÉCURITÉ DE MORUS ALBA L'administration intragastrique d'extrait de Morus alba chez le rat pendant 7 jours à la dose maximale de 1 g/kg n'a pas produit d'effets toxiques (Jiao Y et al., 2017). Une étude menée sur des rats dans laquelle les effets d'extraits éthanoliques de Morus alba chez le rat à la dose de 250mg/kg pendant 2 semaines d'administration n'ont pas provoqué d'effets toxiques (Hwang et al., 2016). Une autre étude menée sur des rats nourris avec des anthocyanes dérivées de fruits de mûrier. Les anthocyanes ont diminué les niveaux élevés d'aspartate aminotransférase (AST) et d'alanine aminotransférase ALT chez les rats. (Effets hépatoprotecteurs) CALCUL DE LA TAILLE DE L'ÉCHANTILLON La taille de l'échantillon a été estimée à l'aide du calculateur de taille d'échantillon Open Epi en tenant compte des statistiques suivantes ; Changement du niveau de pH (Chlorhexidine) = 6,88 ± 0,20 (Velmurugan et al., 2013) et considérant une différence de pH de 20 % pour les extraits de mûrier comme 8,256 ± 0,24 Puissance du test = 90 % Niveau de confiance = 95 % La taille d'échantillon calculée est sortie comme 1 dans chaque groupe. Cependant, j'inclurai 120 patients ayant 40 patients dans chaque groupe selon l'hypothèse de normalité.

MÉTHODOLOGIE DE LA RECHERCHE Cadre de l'étude Cette étude sera menée au département de médecine dentaire, hôpital civil Uthal, district Lasbella et au département de pathologie végétale, Université Lasbella des sciences agricoles, aquatiques et marines (LUAWMS) Balouchistan.

Conception de l'étude Essai clinique contrôlé randomisé Il s'agit d'une étude en double aveugle, dans laquelle le chercheur et le patient seront aveuglés pour que les résultats restent impartiaux. Cependant, le co-investigateur saura que le patient reçoit un traitement de référence ou un rince-bouche à base de plantes.

Durée de l'étude La durée de l'étude sera de 6 mois à 1 an après approbation de l'étude par le RAC, l'ERC et le BASR de l'Université Ziauddin.

Technique d'échantillonnage Une technique d'échantillonnage consécutif non probabiliste sera utilisée pour la sélection de l'échantillon

Critères de sélection Critères d'inclusion Tous les patients âgés de 18 à 40 ans ayant au moins 20 dents en bouche et n'incluant pas les dents de sagesse.

Les patients des deux sexes. Les patients présentant des lésions carieuses actives et non traitées (au moins une dent cariée doit être présente dans la cavité buccale du patient).

Critères d'exclusion Les patients sous traitement orthodontique Les patients sous antibiothérapie ou rinçage antimicrobien. Les patients ayant une allergie au bain de bouche à la chlorhexidine Les patients dont le consentement n'a pu être obtenu MATÉRIEL ET MÉTHODE MATÉRIEL UTILISÉ DANS L'ÉTUDE Le matériel utilisé dans l'étude sera un bain de bouche à la chlorhexidine, un fruit de Morus alba, un pH-mètre, une gélose sélective et des plaques de culture pour Streptococcus mutans, test tubes et kits de collecte de salive.

COLLECTION DE MORUS ALBA Les fruits de Morus alba (mûrier blanc) seront obtenus auprès d'un magasin de fines herbes authentique et les fruits de Morus alba seront authentifiés par le département de botanique de LUAWMS.

PRÉPARATION D'EXTRAIT AQUEUX DE FRUIT DE MORUS ALBA La préparation sera effectuée dans le département de pathologie végétale LUAWMS. Les fruits de Morus alba seront lavés à l'eau distillée et pourront sécher. Ensuite, le matériel fruitier (Morus alba) sera broyé à l'aide d'un mortier et d'un pilon. Pour une préparation aqueuse à 20 %, 100 ml d'eau distillée seront ajoutés à 20 g de poudre broyée et seront incubés dans un incubateur à agitation pendant 8 heures. (Pour une préparation aqueuse à 30%, 100ml d'eau distillée seront ajoutés à 30g de poudre broyée). Les extraits aqueux seront filtrés sur papier filtre Watman n° 1 (Schuell et Schleicher 125 mm Cat n° 1001 125) (Shumaila naz et al., 2018).

STANDARDISATION DES PARTICIPANTS Les sujets sélectionnés selon les critères d'inclusion seront standardisés. Il sera conseillé aux participants de se brosser les dents deux fois par jour (après le petit-déjeuner le matin et au coucher) et d'éviter la malbouffe. Il sera conseillé aux participants de prendre des boissons sucrées (thé, café, boisson sucrée) pas plus de 2 fois par jour. Ces instructions seront également remises aux participants sous forme écrite. Les participants seront invités à agir conformément à ces conseils et seront appelés après 1 semaine pour des échantillons salivaires de base.

PROCÉDURE DE COLLECTE DES DONNÉES Un total de 120 patients remplissant les critères d'inclusion seront inclus dans l'étude. Des consentements éclairés seront recueillis auprès de tous les participants. Lors de la prise de consentement, les patients seront informés qu'ils recevront soit l'étalon-or (chlorhexidine) soit un bain de bouche à base de plantes. La sélection des patients soit dans le groupe A, B ou C se fera par la méthode Random Number Table. L'étiquetage du groupe en tant que A, B et C sera effectué par le co-investigateur. La liste des groupes sera scellée dans une enveloppe opaque et sera ouverte lorsque l'étude sera terminée.

GROUPES D'ÉTUDE Un total de 120 participants seront inclus dans l'étude. Les participants seront également répartis en trois groupes (groupe A, B et C). Les participants du groupe A recevront un bain de bouche à la chlorhexidine et les participants des groupes B et C recevront respectivement 20 % et 30 % d'extrait aqueux de Morus alba.

ANALYSE DU pH SALIVAIRE L'analyse du niveau de pH salivaire sera effectuée à l'aide d'un pH-mètre et le pH salivaire sera enregistré au départ et 15 jours après l'utilisation du rince-bouche respectif.

PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE Les échantillons salivaires non stimulés de base de 5 ml seront prélevés sur les participants par la technique de bave passive, puis 3 ml seront utilisés pour la mesure du pH salivaire et l'échantillon salivaire restant sera stocké à 0 C, puis sera transféré au laboratoire pour le évaluation de Streptococcus mutans. Après avoir prélevé des échantillons salivaires de base, les participants seront invités à rincer et à maintenir 10 ml de rince-bouche respectif pendant 30 secondes dans leur bouche avant de le cracher. La procédure sera répétée par les participants, deux fois par jour pendant 15 jours. Après 15 jours, des échantillons salivaires seront à nouveau prélevés sur les participants pour l'évaluation de Streptococcus mutans et les résultats obtenus seront comparés aux échantillons salivaires de référence pour Streptococcus mutans.

PROCÉDURE DE CULTURE La technique d'évaluation du contenu microbien sera la méthode de dilution et d'étalement sur plaque. L'analyse microbienne salivaire sera effectuée en diluant chaque échantillon salivaire dans un rapport de 1:10 dans de l'eau distillée. Chaque échantillon sera ensuite strié dans une plaque contenant un milieu de gélose Mitis salivarius (MSA). Les plaques seront ensuite incubées pendant 48 heures à 37°C et le nombre de colonies de Streptococcus mutans (CFU) sera compté sous microscope binoculaire auto-éclairant. Tous les résultats seront enregistrés dans un formulaire préconçu. (Smariti sexena et al,. 2017, Velmurugan et al,. 2013, Hongkun Wu et al., 2003) ANALYSE STATISTIQUE Les données seront analysées à l'aide de SPSS version 23. La moyenne et l'écart type seront pris pour les données numériques. La fréquence et les pourcentages seront pris pour les données catégorielles.

Un test t apparié sera effectué pour comparer les valeurs pré et post-intervention du nombre de bactéries et des valeurs de pH pour chaque groupe et l'ANOVA avec le test de Tukey post hoc sera appliqué pour la comparaison entre les trois groupes. P < 0,05 sera considéré comme statistiquement significatif.

CONSIDERATION ETHIQUE L'approbation éthique sera prise par le comité d'éthique de l'Université Ziauddin. Le consentement éclairé sera obtenu de chaque sujet avant l'enregistrement de toute mesure. Toutes les informations recueillies dans le cadre de l'étude resteront strictement confidentielles. L'anonymat de tous les sujets sera maintenu par un stockage soigneux des informations. Si des problèmes dentaires sont constatés, les patients seront informés et dirigés vers les cliniques concernées pour le traitement nécessaire.

PORTÉE DE L'ÉTUDE Si les résultats de notre étude prouvent que Morus alba est plus efficace, alors qu'il est dérivé d'une source naturelle, un agent sûr, peu coûteux et respectueux de l'environnement sera disponible à l'avenir pour la prévention des caries dentaires. Le Morus alba pourrait également être utilisé pour les enfants et ceux qui ne peuvent pas utiliser de bains de bouche synthétiques en raison d'une irritation, d'une altération du goût, d'une sensation de brûlure et pour des raisons esthétiques.

Morus alba, comme d'autres produits à base de plantes, est respectueux de l'environnement et sa formulation en tant que rince-bouche antimicrobien aide à minimiser les effets toxiques sur l'environnement produits par la chlorhexidine de rince-bouche produite chimiquement, qui est actuellement l'agent de référence pour les transports dentaires. Les résultats de cette étude pourraient ouvrir des portes à d'autres recherches sur d'autres produits à base de plantes traditionnellement utilisés pour leur potentiel antimicrobien.