EFICACIA DE LOS EXTRACTOS DE FRUTO DE MORUS ALBA Y CLORHEXIDINA SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS SALIVARES Y NIVELES DE pH

INTRODUCCIÓN Streptococcus mutans es el principal patógeno implicado en el desarrollo de la caries dental. Este es un coco anaerobio gram positivo, presente de forma natural en la microbiota oral y puede colonizar fácilmente la superficie del diente e inicia la producción de ácido mediante la combinación de polisacáridos extracelulares que resultan en la desmineralización del diente y el desarrollo de caries dental (Shah et al., 2018) . La cantidad de superficies colonizadas se asocia con Streptococcus mutans en la saliva. Por lo tanto, al disminuir la concentración de Streptococcus mutans en la cavidad bucal tendría una ventaja significativa en la reducción de la aparición de microbios cariogénicos. (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas and Drake., 2018) La caries dental es una enfermedad microbiana de la cavidad bucal, que se identifica por la desmineralización de las sustancias inorgánicas y disolución de las sustancias orgánicas de la dientes. La caries dental se ha reconocido a lo largo de la historia y existe en todo el mundo, se informa que es del 44%, pero la gravedad y la prevalencia cambian en diferentes países (J.V Soames y J.C Southam et al., 2018). En nuestros países vecinos, la frecuencia de caries dental es bastante alta, documentada en 68%, 65% y 64% en China, Irán e India respectivamente. La prevalencia de caries dental en Pakistán también es bastante alta, en torno al 62 %, lo que se asocia con una importante morbilidad y consecuencias económicas (Reddy K S, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013) La caries dental implica básicamente el contacto entre los estructura dental, los azúcares y la biopelícula formada en las superficies dentales (Pitts, N. B et al., 2016). El proceso de caries compuesto por la alteración de los períodos de desmineralización y remineralización del diente, que, si la desmineralización neta ocurre durante un tiempo adecuado, da como resultado el inicio de la caries dental. La causa de la caries dental es el ácido láctico producido por la fermentación de azúcares por las bacterias orales (Banas y Drake., 2018). El nivel normal de pH de la saliva es de 6,2 a 7,6. A pH neutro, los iones de calcio y fosfato de la saliva se incorporan al esmalte y mantienen la estructura del esmalte, pero cuando el nivel de pH cae por debajo de lo normal, es decir, a 5,5 o menos de 5,5, los iones de calcio y fosfato del esmalte se filtran y provocan el intercambio de iones minerales de los cristales de hidroxiapatita del esmalte a la placa, lo que da como resultado la desmineralización del diente (J.V Soames Oral pathology 2018).

El manejo de la caries dental se enfoca en reducir la desmineralización de los dientes cambiando los hábitos alimenticios, alterando o inhibiendo el crecimiento bacteriano, cambiando el nivel de pH salival y la capacidad amortiguadora (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018). Se han utilizado diferentes enjuagues bucales, dentífricos, geles, chicles y barnices sintéticos antimicrobianos para mejorar la higiene bucal y prevenir la caries dental al atacar los microorganismos cariogénicos. La prevención de la caries dental se realiza mediante el cepillado de la boca después de las comidas, el uso de pastas dentales con flúor, enjuagues bucales antimicrobianos, auxiliares de limpieza interdental, estimulantes salivales (xilitol, manitol), selladores de fosas y fisuras y la aplicación tópica de flúor en las superficies de los dientes. Los enjuagues bucales también reducen la inflamación gingival e inhiben la formación de placa (Velmurugan et al., 2013, Chen and Wang, 2010, Zajkani et al., 2018). Los enjuagues bucales tienen efectos anticariogénicos, pero tienen ciertas desventajas. Son costosos, tienen efectos secundarios que incluyen tinción de los dientes y sensación de ardor en la cavidad bucal (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018).

La clorhexidina es el enfoque químico estándar, de uso común y más efectivo para disminuir la acumulación de placa. Se ha demostrado que el enjuague bucal diario con clorhexidina (0,2 %) reduce la tasa de crecimiento de Streptococcus mutans en la cavidad oral (Velmurugan et al., 2013). Sin embargo, tiene ciertos efectos secundarios, es decir, erosión de la mucosa oral, hinchazón de la parótida, tinción de los dientes, sensación de ardor y sabor amargo. (Jacob y Nivedhitha, 2018b, Shah et al., 2018, Van der Weijden et al., 2010, Nayak et al., 2012, Solderer et al., 2019) Muchas poblaciones utilizan plantas medicinales como tratamientos tradicionales o alternativos para diversas dolencias debido a sus mejores perfiles de seguridad, efectos beneficiosos para la salud, menor costo y fácil disponibilidad. Entre las especies de plantas utilizadas con fines medicinales se encuentran las del género Morus, entre las especies más utilizadas se encuentran Morus alba, rubra y nigra, que también han mostrado propiedades antimicrobianas contra diversas infecciones que amenazan la vida (Ercisli S et al., 2006). Morus alba comúnmente llamado morera blanca, y pertenece a la familia Moraceae, también se llama Tut, shahtoot o morera. Morus Alba (morera blanca) es originaria de China, India, Pakistán y Japón (Kumar V et al., 2008). En el estudio actual, el extracto de la fruta de Morus alba se comparará con la clorhexidina contra Streptococcus mutans contra patógenos orales debido a sus propiedades antimicrobianas.

Declaración del problema La caries dental es muy frecuente en todo el mundo, incluido Pakistán; provoca pérdida de dientes, maloclusión y problemas en la articulación temporomandibular. Las infecciones asociadas pueden conllevar el riesgo de diseminarse a los espacios fasciales superficiales y profundos e incluso pueden causar infecciones potencialmente mortales. El tratamiento de la caries dental es bastante costoso y representa una carga económica para nuestra población de bajo nivel socioeconómico, que ya está desfavorecida. Por lo tanto, existe la necesidad de explorar productos naturales que puedan tener efectos antimicrobianos y otros efectos beneficiosos para disminuir la actividad de la caries junto con buenos perfiles de seguridad, fácilmente disponibles y rentables.

Pregunta de investigación ¿Son los extractos acuosos del fruto de Morus alba igual de efectivos que el enjuague bucal con clorhexidina para la prevención de la caries dental? Objetivos Comparar la eficacia de los extractos del fruto de Morus alba con clorhexidina en pacientes con caries dental sobre la base de la reducción de los recuentos de Streptococcus mutans en su saliva.

Comparar la eficacia de los extractos del fruto de Morus alba con la clorhexidina en pacientes con caries dental sobre la base del aumento de los niveles de pH salival.

Justificación La clorhexidina es una sustancia química que tiene un sabor amargo y causa una sensación de ardor en la cavidad oral y puede no ser factible para los pacientes debido a razones estéticas. El enjuague bucal derivado de productos a base de hierbas, que tiene actividad antimicrobiana contra los patógenos orales, podría proporcionar una opción de tratamiento económica y segura para reducir la carga de caries dental en nuestro entorno clínico. Hasta donde sabemos, el extracto de morera no ha sido evaluado por su actividad antimicrobiana contra patógenos orales, incluido Streptococcus mutans.

Hipótesis

Hipótesis nula:

Ho: Los extractos acuosos del fruto de Morus alba no son tan efectivos como el enjuague bucal con clorhexidina para la prevención de la caries dental.

Hipótesis alternativa:

Ha: Los extractos acuosos del fruto de Morus alba son igualmente efectivos que el enjuague bucal con clorhexidina para la prevención de la caries dental.

REVISIÓN DE LA LITERATURA La caries dental consiste en conexiones entre las estructuras dentales, los azúcares y la biopelícula microbiana en las superficies dentales (Pitts, N. B et al., 2016). Streptococcus mutans y el pH salival son los dos factores principales que causan la caries dental y, por lo tanto, atacarlos puede ser una ruta eficiente para abordar esta enfermedad global. La clorhexidina es un excelente agente antimicrobiano y se considera de gran ayuda para mantener la salud y la higiene bucal. De manera similar, se han introducido muchos agentes herbales que son tan efectivos como la clorhexidina. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob and Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017) Muchas poblaciones han utilizado las plantas medicinales como agente terapéutico debido a su fácil disponibilidad, seguridad y rentabilidad. Las especies morus también tienen propiedades medicinales y se han utilizado como antidiabéticos, neuroprotectores, hipolipemiantes y como laxantes (Anna Gryn-Rynko et al., 2016). Más de 100 especies de morus están presentes en todo el mundo y en Pakistán hay 25 especies de morus disponibles. Las especies de morus más comunes son Morus alba, rubra y nigra (Imran M., Khan H., et al., 2010).

La fruta de Morus alba contiene muchas sustancias activas, como flavonoles, polifenoles, alcaloides y polisacáridos (Gundogdu M et al., 2011). Morus alba es una rica fuente de vitamina A, vitamina B1, ácido fólico, vitamina C, minerales, carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos, antocianina y saponinas (Jiang Y et al., 2015).

En la medicina natural china convencional, la fruta de la morera se ha utilizado en medicamentos humanos para tratar la diabetes, la hipertensión, la anemia y el dolor en las articulaciones. Morus alba ha sido conocida por sus propiedades antidiabéticas, antihelmínticas, antimicrobianas, ansiolíticas, hepatoprotectoras y nefroprotectoras (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ). El fruto de Morus, aunque de la misma especie, puede contener diferentes propiedades antioxidantes así como diferente composición química. Los elementos minerales en Morus alba incluyen potasio (K), sodio (Na), fósforo (P), calcio (Ca), zinc (Zn), hierro (Fe), cobre (Cu), manganeso (Mn), selenio (Se ), magnesio (Mg), cromo (Cr) y arsénico (As) (Liang, L et al., 2012).

El extracto metanólico de la corteza de Morus alba y sus constituyentes se utilizan como agentes antimicrobianos (Kuete, et al., 2009). El agente antimicrobiano "kuwanon G" obtenido de la corteza de la raíz de Morus alba ha indicado actividad contra Streptococcus mutans a una CIM de 8,0 μg/ml. La prueba bactericida de kuwanon G indicó que inactivaba totalmente Streptococcus mutans a la concentración de 20 μg/ml en 60 segundos (Park, K. M et al., 2002).

Según Jha et al, evaluó la actividad antimicrobiana de las hojas de Morus alba (extracto acuoso) en bacterias grampositivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) y gramnegativas (Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli). Los resultados de la actividad antimicrobiana confirmaron que Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli fueron las especies bacterianas más susceptibles al extracto crudo, mostraron el valor MIC a una concentración de 0.2-26 mg/mL (S. Jha, AK et al., 2013).

Se evaluó la actividad antimicrobiana de la 1-desoxinojirmicina (componente de las hojas de Morus alba) y del extracto etanólico crudo de las hojas de Morus alba. Tanto la 1-desoxinojirmicina como las hojas de morus alba (extracto crudo) mostraron una fuerte actividad bacteriostática contra Streptococcus mutans, pero la 1-desoxinojirmicina mostró un valor MIC más bajo (15,6 mg/ml) que el extracto crudo de Morus alba (125 mg/mg/ml) (B. Islam., et al 2008). El extracto etanólico de hojas de Morus alba mostró actividad antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida krusei, Candida albicans, Aspergillus flavus y Candida tropicalis (Oliveira et al., 2015).

Las antocianinas son el componente más importante de la fruta de Morus alba, que son compuestos fenólicos responsables de muchas actividades biológicas, como propiedades antimicrobianas, antioxidantes, neuroprotectoras y antiinflamatorias (Liu LK et al., 2008). La cianidina-3-glucósido y la cianidina-3-rutinosido son las principales antocianinas separadas del fruto de la morera (Suh H.J et al 2003, Liu X.et al 2004). El ingrediente activo de Morus alba es la antocianina y la antocianina presente en el fruto de las especies de Morus mostró actividades antibacterianas contra E. coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus (Chen H., et al 2017). Los mecanismos propuestos por los cuales la antocianina produce efectos antimicrobianos incluyen la acción sobre la membrana celular del patógeno con la fuga de su ácido nucleico y proteínas (Bajpai et al., 2013). La antocianina provoca la inhibición de la superóxido dismutasa microbiana, la fosfatasa alcalina y la producción de ATP con la posterior inhibición del ciclo TCA (Li et al., 2010). Todos estos mecanismos dan como resultado la lisis de las células patógenas.

Shumaila Naz et al confirmaron la actividad antimicrobiana de los extractos de frutos de morera contra patógenos microbianos transmitidos por el agua (Listeria monocytogene, Salmonella enteric, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Clostridium sp., Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Corneybacterium sp. ., Bacillus subtilis, , E. coli, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptococcus pyogenes, Actinomyces sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhi, Bacillus anthracis y Streptococcus pneumonia) aisladas de diferentes muestras de agua. Los resultados indicaron que los extractos de frutos de morera son efectivos contra los patógenos microbianos transmitidos por el agua (Shumaila Naz et al., 2018).

PERFILES DE SEGURIDAD DE MORUS ALBA La administración intragástrica de extracto de Morus alba en ratas durante 7 días a la dosis máxima de 1 g/kg no produjo efectos tóxicos (Jiao Y et al., 2017). Estudio realizado en ratas en el que los efectos de los extractos etanólicos de Morus alba en ratas a la dosis de 250mg/kg durante 2 semanas de administración no provocaron efectos tóxicos (Hwang et al., 2016). Otro estudio realizado en ratas que fueron alimentadas con antocianinas derivadas de la fruta de la morera. Las antocianinas disminuyeron los niveles elevados de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa ALT en ratas. (Efectos hepatoprotectores) CÁLCULO DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA El tamaño de la muestra se estimó utilizando la calculadora de tamaño de muestra Open Epi considerando las siguientes estadísticas; Cambio en el nivel de pH (clorhexidina) = 6,88±0,20 (Velmurugan et al., 2013) y considerando una diferencia del 20% en el pH para extractos de morera como 8,256±0,24 Poder de prueba= 90% Nivel de confianza= 95% El tamaño de muestra calculado resultó ser 1 en cada grupo. Sin embargo, incluiré 120 pacientes con 40 pacientes en cada grupo según el supuesto de normalidad.

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN Ámbito del estudio Este estudio se llevará a cabo en el departamento de Odontología del Hospital Civil Uthal, distrito de Lasbella y en el departamento de Fitopatología de la Universidad de Agricultura, Agua y Ciencias Marinas de Lasbella (LUAWMS) Baluchistán.

Diseño del estudio Ensayo clínico controlado aleatorio Es un estudio doble ciego, en el que tanto el investigador como el paciente estarán ciegos para mantener los resultados imparciales. Sin embargo, el co-investigador sabrá que el paciente está recibiendo el estándar de oro o un enjuague bucal a base de hierbas.

Duración del estudio La duración del estudio será de 6 meses a 1 año después de la aprobación del estudio de RAC, ERC y BASR de la Universidad de Ziauddin.

Técnica de muestreo Se empleará la técnica de muestreo consecutivo no probabilístico para la selección de la muestra.

Criterios de selección Criterios de inclusión Todos los pacientes de 18 a 40 años de edad con al menos 20 dientes en la boca y sin incluir las muelas del juicio.

Los pacientes de ambos sexos. Los pacientes con lesiones cariosas activas y no tratadas (al menos un diente cariado debe estar presente en la cavidad oral del paciente).

Criterios de exclusión Los pacientes en tratamiento de ortodoncia Los pacientes que ya estén en tratamiento antibiótico o enjuague antimicrobiano. Los pacientes con alergia al colutorio de clorhexidina Los pacientes cuyos consentimientos no se pudieron obtener MATERIALES Y MÉTODO MATERIALES UTILIZADOS EN EL ESTUDIO Los materiales utilizados en el estudio serán colutorio de clorhexidina, fruto de Morus alba, medidor de pH, agar selectivo y placas de cultivo para Streptococcus mutans, test tubos y kits de recolección de saliva.

COLECCIÓN DE MORUS ALBA La fruta de Morus alba (morera blanca) se obtendrá de una tienda de hierbas auténtica y la fruta de Morus alba se autenticará en el departamento de Botánica de LUAWMS.

PREPARACIÓN DE EXTRACTO ACUOSO DE FRUTO DE MORUS ALBA La preparación se realizará en el departamento de Fitopatología LUAWMS. La fruta de Morus alba se lavará con agua destilada y se dejará secar. Luego, el material de la fruta (Morus alba) se triturará con la ayuda de un mortero. Para una preparación acuosa al 20 %, se agregarán 100 ml de agua destilada a 20 g de polvo molido y se incubarán en una incubadora con agitación durante 8 horas. (Para una preparación acuosa al 30 %, se agregarán 100 ml de agua destilada a 30 g de polvo molido). Los extractos acuosos se filtrarán a través de papel de filtro Watman No. 1 (Schuell and Schleicher 125 mm Cat No. 1001 125) (Shumaila naz et al., 2018).

ESTANDARIZACIÓN DE PARTICIPANTES Se estandarizarán los sujetos seleccionados según criterios de inclusión. Se aconsejará a los participantes que se cepillen los dientes dos veces al día (después del desayuno por la mañana ya la hora de acostarse) y que eviten la comida chatarra. Se recomendará a los participantes que tomen bebidas azucaradas (té, café, bebidas azucaradas) no más de 2 veces al día. Estas Instrucciones también se entregarán a los participantes por escrito. Se indicará a los participantes que actúen de acuerdo con esta guía y se les llamará después de 1 semana para obtener muestras salivales de referencia.

PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE DATOS Se inscribirá en el estudio un total de 120 pacientes que cumplan los criterios de inclusión. Se tomará el consentimiento informado de todos los participantes. Mientras se toma el consentimiento, se informará a los pacientes que recibirán el estándar de oro (clorhexidina) o un enjuague bucal a base de hierbas. La selección de pacientes ya sea en el grupo A, B o C se hará por el método de Tabla de Números Aleatorios. El etiquetado del grupo como A, B y C será realizado por el coinvestigador. La lista de grupos se sellará en un sobre opaco y se abrirá cuando se complete el estudio.

GRUPOS DE ESTUDIO Se incluirá un total de 120 participantes en el estudio. Los participantes se dividirán equitativamente en tres grupos (grupo A, B y C). Los participantes del grupo A recibirán colutorio de Clorhexidina y los participantes del grupo B y C extracto acuoso del fruto de Morus alba al 20% y 30% respectivamente.

ANÁLISIS DEL pH SALIVAL El análisis del nivel de pH salival se realizará con un medidor de pH y el pH salival se registrará al inicio y 15 días después del uso del enjuague bucal respectivo.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se tomarán 5 ml de muestras de saliva no estimuladas de referencia de los participantes mediante la técnica de babeo pasivo, luego se usarán 3 ml para medir el pH salival y la muestra de saliva restante se almacenará a 0 C, y luego se transferirá al laboratorio para el evaluación de Streptococcus mutans. Después de tomar las muestras salivales de referencia, se les pedirá a los participantes que se enjuaguen y mantengan 10 ml del enjuague bucal respectivo durante 30 segundos en la boca antes de escupirlo. El procedimiento será repetido por los participantes, dos veces al día durante 15 días. Después de 15 días, se tomarán nuevamente muestras salivales de los participantes para la evaluación de Streptococcus mutans y los resultados obtenidos se compararán con las muestras salivales basales para Streptococcus mutans.

PROCEDIMIENTO DE CULTIVO La técnica para evaluar el contenido microbiano será el método de dilución y extensión en placa. El análisis microbiano salival se realizará diluyendo cada muestra salival en una proporción de 1:10 en agua destilada. Luego, cada muestra se colocará en una placa con medio de agar Mitis salivarius (MSA). A continuación, las placas se incubarán durante 48 horas a 37 °C y se contará el número de colonias de Streptococcus mutans (UFC) bajo un microscopio binocular autoiluminado. Todos los hallazgos se registrarán en formularios prediseñados. (Smariti sexena et al,. 2017, Velmurugan et al. 2013, Hongkun Wu et al., 2003) ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos se analizarán con SPSS versión 23. Se tomará la media y la desviación estándar para los datos numéricos. Para datos categóricos se tomará frecuencia y porcentajes.

Se realizará la prueba t pareada para la comparación entre los valores pre y post intervención de los recuentos bacterianos y los valores de pH para cada grupo y se aplicará el ANOVA con la prueba post hoc de Tukey para la comparación entre los tres grupos. P < 0,05 se considerará estadísticamente significativo.

CONSIDERACIÓN ÉTICA La aprobación ética se tomará del Comité de Ética de la Universidad Ziauddin. Se obtendrá el consentimiento informado de cada sujeto antes de registrar cualquier medición. Toda la información recopilada del estudio se mantendrá estrictamente confidencial. Se mantendrá el anonimato de todos los sujetos mediante el almacenamiento cuidadoso de la información. Si se nota algún problema relacionado con la odontología, los pacientes serán informados y remitidos a las clínicas correspondientes para el tratamiento necesario.

IMPORTANCIA DEL ESTUDIO Si los resultados de nuestro estudio demuestran que Morus alba es más efectivo, entonces, al ser derivado de una fuente natural, en el futuro estará disponible un agente seguro, de bajo costo y ecológico para la prevención de la caries dental. El Morus alba también puede ser utilizado por niños y aquellos que no pueden usar enjuagues bucales sintéticos por irritación, alteración del gusto, sensación de ardor y por motivos estéticos.

Morus alba, al igual que otros productos a base de hierbas, es ecológico y su formulación como un enjuague bucal antimicrobiano ayuda a minimizar los efectos tóxicos en el medio ambiente producidos por la clorhexidina de enjuague bucal producida químicamente, que actualmente es el agente estándar de oro para los productos dentales. Los resultados de este estudio pueden abrir puertas para otras investigaciones sobre otros productos herbales utilizados tradicionalmente por su potencial antimicrobiano.