EFICÁCIA DE EXTRATOS DE FRUTAS DE MORUS ALBA E CLORHEXIDINA SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS SALIVARES E NÍVEIS DE pH

INTRODUÇÃO O Streptococcus mutans é o principal patógeno envolvido no desenvolvimento da cárie dentária. Este é um coco gram positivo anaeróbico, naturalmente presente na microbiota oral e pode facilmente colonizar a superfície do dente e iniciar a produção de ácido pela combinação de polissacarídeo extracelular que resulta na desmineralização do dente e desenvolvimento de cárie dentária (Shah et al., 2018) . A quantidade de superfícies colonizadas está associada a streptococcus mutans na saliva. Assim, diminuir a concentração de Streptococcus mutans na cavidade bucal teria uma vantagem significativa na redução da ocorrência de micróbios cariogênicos. (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas e Drake., 2018) A cárie dentária é uma doença microbiana da cavidade oral, identificada pela desmineralização das substâncias inorgânicas e dissolução das substâncias orgânicas da cavidade oral. dentes. A cárie dentária foi reconhecida ao longo da história e existe em todo o mundo, relatada em 44%, mas a gravidade e a prevalência mudam em diferentes países (J.V Soames e J.C Southam et al., 2018). Em nossos países vizinhos, a frequência de cárie dentária é bastante alta, documentada em 68%, 65% e 64% na China, Irã e Índia, respectivamente. A prevalência de cárie dentária no Paquistão também é bastante alta, cerca de 62%, o que está associado a significativa morbidade e consequências econômicas (Reddy K S, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013). estrutura do dente, os açúcares e o biofilme formado nas superfícies dos dentes (Pitts, N. B et al., 2016). O processo de cárie é composto por períodos alternados de desmineralização e remineralização do dente, que, se ocorrer desmineralização líquida em tempo adequado, resulta no início da cárie dentária. A causa da cárie dentária é o ácido lático produzido pela fermentação de açúcares por bactérias orais (Banas e Drake., 2018). O nível normal de pH da saliva é 6,2-7,6. Em pH neutro, os íons de cálcio e fosfato da saliva se incorporam ao esmalte e mantêm a estrutura do esmalte, mas quando o nível de pH cai abaixo do normal, ou seja, em 5,5 ou abaixo de 5,5, os íons de cálcio e fosfato do esmalte vazam e causam a troca de íons minerais dos cristais de hidroxiapatita do esmalte para a placa, resultando na desmineralização do dente (J.V Soames Oral pathology 2018).

O controle da cárie dentária enfatiza a redução da desmineralização dentária, alterando os hábitos alimentares, alterando ou inibindo o crescimento bacteriano, alterando o nível de pH salivar e a capacidade tampão (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018). Diferentes enxaguatórios bucais sintéticos antimicrobianos, cremes dentais, géis, gomas de mascar e vernizes têm sido utilizados para melhorar a higiene bucal e prevenir a cárie dentária, visando microrganismos cariogênicos. A prevenção da cárie dentária é feita por escovação bucal após as refeições, uso de cremes dentais com flúor, enxaguatórios bucais antimicrobianos, auxiliares de limpeza interdental, estimulantes salivares (xilitol, manitol), selantes de fóssulas e fissuras e aplicação de flúor tópico nas superfícies dos dentes. Os enxaguatórios bucais também reduzem a inflamação gengival e inibem a formação de placa (Velmurugan et al., 2013, Chen e Wang, 2010, Zajkani et al., 2018). Os enxaguatórios bucais têm efeitos anticariogênicos, mas apresentam algumas desvantagens. Eles são caros, têm efeitos colaterais, incluindo manchas nos dentes e sensação de queimação na cavidade oral (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018).

A clorexidina é o padrão-ouro, comumente usado e a abordagem química mais eficaz para diminuir o acúmulo de placa. Foi demonstrado que enxaguar a boca diariamente com clorexidina (0,2%) reduz a taxa de crescimento de streptococcus mutans na cavidade oral (Velmurugan et al., 2013). No entanto, tem alguns efeitos colaterais, ou seja, erosão da mucosa oral, inchaço da parótida, coloração dos dentes, sensação de queimação e gosto amargo. (Jacob e Nivedhitha, 2018b, Shah et al., 2018, Van der Weijden et al., 2010, Nayak et al., 2012, Solderer et al., 2019) Muitas populações usam plantas medicinais como tratamentos tradicionais ou alternativos para várias doenças devido aos seus melhores perfis de segurança, efeitos benéficos para a saúde, menor custo e fácil disponibilidade. Entre as espécies de plantas usadas para fins medicinais estão as do gênero Morus, incluindo as espécies mais comumente usadas como Morus alba, rubra e nigra, que também demonstraram propriedades antimicrobianas contra várias infecções potencialmente fatais (Ercisli S et al., 2006). Morus alba comumente chamado de amora branca, e pertence à família Moraceae é também chamado de Tut, shahtoot ou amora. Morus Alba (amoreira branca) é nativa da China, Índia, Paquistão e Japão (Kumar V et al., 2008). No presente estudo, o extrato da fruta Morus alba será comparado com clorexidina para Streptococcus mutans contra patógenos orais devido às suas propriedades antimicrobianas.

Declaração do problema A cárie dentária é altamente prevalente em todo o mundo, incluindo o Paquistão; causa perda dentária, má oclusão e problemas na articulação temporomandibular. As infecções associadas podem acarretar risco de disseminação para os espaços fasciais superficiais e profundos e, até mesmo, podem causar infecções potencialmente fatais. O tratamento da cárie dentária é bastante caro e representa um fardo econômico para nossa população socioeconômica já carente. Assim, há necessidade de exploração de produtos naturais que possam ter efeitos antimicrobianos e outros efeitos benéficos para diminuir a atividade de cárie juntamente com bons perfis de segurança, facilmente disponíveis e de baixo custo.

Questão de pesquisa Os extratos aquosos da fruta Morus alba são igualmente eficazes como enxaguatório bucal de clorexidina para a prevenção da cárie dentária? Objetivos Comparar a eficácia dos extratos da fruta Morus alba com clorexidina em pacientes com cárie dentária com base na redução da contagem de Streptococcus mutans em sua saliva.

Comparar a eficácia dos extratos da fruta Morus alba com a clorexidina em pacientes com cárie dentária com base no aumento dos níveis de pH salivar.

Justificativa A clorexidina é um produto químico com sabor amargo e causa sensação de queimação na cavidade oral e pode não ser viável para os pacientes devido a razões estéticas. Enxaguantes bucais derivados de produtos fitoterápicos, com atividade antimicrobiana contra patógenos orais, podem fornecer uma opção de tratamento econômica e segura para reduzir a carga de cárie dentária em nosso cenário clínico. Até onde sabemos, o extrato de amora não foi avaliado quanto à sua atividade antimicrobiana contra patógenos orais, incluindo Streptococcus mutans.

Hipótese

hipótese nula:

Ho: Os extratos aquosos da fruta Morus alba não são tão eficazes quanto o colutório de clorexidina para a prevenção da cárie dentária.

Hipótese Alternativa:

Ha: Extratos aquosos da fruta Morus alba são igualmente eficazes como colutórios de clorexidina para a prevenção de cáries dentárias.

REVISÃO DA LITERATURA A cárie dentária consiste em conexões entre as estruturas dentárias, açúcares e o biofilme microbiano nas superfícies dentárias (Pitts, N. B et al., 2016). Streptococcus mutans e pH salivar são os dois principais fatores que causam cárie dentária e, portanto, combatê-los pode ser uma rota eficiente para combater esta doença global. A clorexidina é um excelente agente antimicrobiano e considerado um benefício para a manutenção da saúde e higiene bucal. Da mesma forma, foram introduzidos muitos agentes fitoterápicos que são tão eficazes quanto a clorexidina. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob e Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017) As plantas medicinais têm sido utilizadas por muitas populações como um agente terapêutico por causa de sua fácil disponibilidade, segurança e economia. As espécies morus também possuem propriedades medicinais e têm sido utilizadas como antidiabéticas, neuroprotetoras, hipolipidêmicas e como laxantes (Anna Gryn-Rynko et al., 2016). Mais de 100 espécies de morus estão presentes em todo o mundo e no Paquistão existem 25 espécies de morus disponíveis. As espécies de morus mais comuns são Morus alba, rubra e nigra (Imran M., Khan H., et al., 2010).

A fruta Morus alba contém muitas substâncias ativas, como flavonóis, polifenóis, alcalóides e polissacarídeos (Gundogdu M et al., 2011). Morus alba é uma rica fonte de vitamina A, vitamina B1, ácido fólico, vitamina C, minerais, carboidratos, aminoácidos, ácidos graxos, antocianina e saponinas (Jiang Y et al., 2015).

Na medicina tradicional chinesa, a fruta da amoreira tem sido utilizada em medicamentos para o tratamento de diabetes, hipertensão, anemia e dores nas articulações. Morus alba é conhecido por suas propriedades antidiabéticas, anti-helmínticas, antimicrobianas, ansiolíticas, hepatoprotetoras e nefroprotetoras (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ). O fruto Morus, embora da mesma espécie, pode conter diferentes propriedades antioxidantes, bem como diferentes composições químicas. Os elementos minerais em Morus alba incluem potássio (K), sódio (Na), fósforo (P), cálcio (Ca), zinco (Zn), ferro (Fe), cobre (Cu), manganês (Mn), selênio (Se ), magnésio (Mg), cromo (Cr) e arsênico (As) (Liang, L et al., 2012).

O extrato metanólico da casca de Morus alba e seus constituintes são utilizados como agentes antimicrobianos (Kuete, et al., 2009). O agente antimicrobiano "kuwanon G" obtido da casca da raiz de Morus alba indicou atividade contra Streptococcus mutans a uma CIM de 8,0 μg/ml. O teste bactericida do kuwanon G indicou que inativou totalmente o Streptococcus mutans na concentração de 20 μg/ml em 60 segundos (Park, K. M et al., 2002).

Segundo Jha et al, ele avaliou a atividade antimicrobiana das folhas de Morus alba (extrato aquoso) em bactérias gram positivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) e gram negativas (Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli). Os resultados da atividade antimicrobiana confirmaram que Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli foram as espécies bacterianas mais suscetíveis ao extrato bruto, apresentaram o valor MIC na concentração de 0,2-26mg/mL (S. Jha, A.K et al., 2013).

A atividade antimicrobiana da 1-desoxinojirmiicina (componente das folhas de Morus alba) e do extrato etanólico bruto das folhas de Morus alba foi avaliada. Tanto a 1-deoxinojirmiicina quanto as folhas de morus alba (extrato bruto) apresentaram forte atividade bacteriostática contra Streptococcus mutans, mas a 1-deoxinojirmiicina apresentou menor valor de MIC (15,6mg/ml) do que o extrato bruto de Morus alba (125mg/mg/mL) (B. Islam., e outros 2008). O extrato etanólico das folhas de Morus alba apresentou atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida krusei, Candida albicans, Aspergillus flavus e Candida tropicalis (Oliveira et al., 2015).

As antocianinas são o constituinte mais significativo da fruta Morus alba, que são compostos fenólicos responsáveis ​​por muitas atividades biológicas, como propriedades antimicrobianas, antioxidantes, neuroprotetoras e anti-inflamatórias (Liu LK et al., 2008). A cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo são as principais antocianinas separadas da amoreira (Suh H.J et al 2003, Liu X.et al 2004). O ingrediente ativo de Morus alba é a antocianina e a antocianina presente no fruto da espécie Morus exibiu atividades antibacterianas contra E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (Chen H., et al 2017). Os mecanismos propostos pelos quais a antocianina produz efeitos antimicrobianos incluem ação na membrana celular do patógeno com o vazamento de seu ácido nucléico e proteínas (Bajpai et al., 2013). A antocianina causa inibição da superóxido dismutase microbiana, fosfatase alcalina e produção de ATP com subsequente inibição do ciclo do TCA (Li et al., 2010). Todos esses mecanismos resultam na lise da célula patogênica.

Shumaila Naz et al confirmaram a atividade antimicrobiana dos extratos de amora contra patógenos microbianos transmitidos pela água (Listeria monocytogene, Salmonella entérica, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Clostridium sp., Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Corneybacterium sp ., Bacillus subtilis, , E. coli, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptococcus pyogenes, Actinomyces sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhi, Bacillus anthracis e Streptococcus pneumonia) isolados de diferentes amostras de água. Os resultados indicaram que os extratos de frutas de amora são eficazes contra patógenos microbianos transmitidos pela água (Shumaila Naz et al., 2018).

PERFIS DE SEGURANÇA DE MORUS ALBA A administração intragástrica de extrato de Morus alba em ratos durante 7 dias na dose máxima de 1gm/kg não produziu efeitos tóxicos (Jiao Y et al., 2017). Um estudo realizado em ratos em que os efeitos dos extratos etanólicos de Morus alba em ratos na dose de 250mg/kg por 2 semanas de administração não causaram efeitos tóxicos (Hwang et al., 2016). Outro estudo realizado em ratos que foram alimentados com antocianinas derivadas da amora. As antocianinas diminuíram os níveis elevados de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase ALT em ratos. (Efeitos hepatoprotetores) CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA O tamanho da amostra foi estimado usando a calculadora de tamanho de amostra Open Epi considerando as seguintes estatísticas; Mudança no nível de pH (clorexidina) = 6,88±0,20 (Velmurugan et al., 2013) e considerando 20% de diferença no pH para extratos de amora como 8,256±0,24 Poder do teste= 90% Nível de confiança= 95% O tamanho amostral calculado resultou em 1 em cada grupo. No entanto, incluirei 120 pacientes com 40 pacientes em cada grupo de acordo com a suposição de normalidade.

METODOLOGIA DE PESQUISA Cenário do estudo Este estudo será realizado no departamento de Odontologia, Hospital Civil Uthal, distrito de Lasbella e no departamento de Patologia Vegetal, Universidade Lasbella de Agricultura, Água e Ciências Marinhas (LUAWMS) Baluchistão.

Desenho do estudo Ensaio clínico controlado randomizado É um estudo duplo-cego, no qual tanto o pesquisador quanto o paciente serão cegados para manter os resultados imparciais. No entanto, o co-investigador saberá que o paciente está recebendo o padrão-ouro ou o enxaguante bucal à base de ervas.

Duração do estudo A duração do estudo será de 6 meses a 1 ano após a aprovação do estudo do RAC, ERC e BASR da Universidade de Ziauddin.

Técnica de amostragem A técnica de amostragem consecutiva não probabilística será empregada para a seleção da amostra

Critérios de seleção Critérios de inclusão Todos os pacientes de 18 a 40 anos com pelo menos 20 dentes na boca e não incluindo os dentes do siso.

Os pacientes de ambos os sexos. Os pacientes com lesões cariosas ativas e não tratadas (pelo menos um dente cariado deve estar presente na cavidade oral do paciente).

Critérios de exclusão Os pacientes em tratamento ortodôntico Os pacientes já em uso de antibioticoterapia ou bochecho antimicrobiano. Os pacientes com alergia ao colutório de clorexidina Os pacientes cujos consentimentos não puderam ser obtidos MATERIAIS E MÉTODO MATERIAIS UTILIZADOS NO ESTUDO Os materiais utilizados no estudo serão colutório de clorexidina, fruto de Morus alba, medidor de pH, ágar seletivo e placas de cultura para Streptococcus mutans, teste tubos e kits de coleta de saliva.

COLEÇÃO MORUS ALBA A fruta Morus alba (Amoreira Branca) será obtida em uma autêntica loja de ervas e a fruta Morus alba será autenticada no departamento de Botânica da LUAWMS.

PREPARAÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE FRUTA DE MORUS ALBA A preparação será feita no departamento de Fitopatologia LUAWMS. Os frutos de Morus alba serão lavados com água destilada e deixados para secar. Em seguida, o material da fruta (Morus alba) será moído com a ajuda de almofariz e pilão. Para preparação aquosa a 20%, 100ml de água destilada serão adicionados a 20g de pó moído e serão incubados em incubadora de agitação por 8 horas. (Para preparação aquosa a 30%, 100ml de água destilada serão adicionados a 30g de pó moído). Os extratos aquosos serão filtrados através de papel filtro Watman No. 1 (Schuell and Schleicher 125 mm Cat No. 1001 125) (Shumaila naz et al., 2018).

PADRONIZAÇÃO DOS PARTICIPANTES Os sujeitos selecionados de acordo com os critérios de inclusão serão padronizados. Os participantes serão orientados a escovar os dentes duas vezes ao dia (depois do café da manhã e na hora de dormir) e evitar junk food. Os participantes serão aconselhados a tomar bebidas açucaradas (chá, café, bebida açucarada) não mais do que 2 vezes ao dia. Estas Instruções também serão dadas aos participantes por escrito. Os participantes serão instruídos a agir de acordo com esta orientação e serão chamados após 1 semana para amostras salivares basais.

PROCEDIMENTO DE COLETA DE DADOS Um total de 120 pacientes preenchendo os critérios de inclusão serão incluídos no estudo. Os consentimentos informados serão obtidos de todos os participantes. Ao obter o consentimento, os pacientes serão informados de que receberão o padrão-ouro (clorexidina) ou enxaguatório bucal à base de ervas. A seleção dos pacientes do grupo A, B ou C será feita pelo método Random Number Table. A rotulagem do grupo como A, B e C será feita pelo co-investigador. A lista de grupos será selada em envelope opaco e será aberta quando o estudo for concluído.

GRUPOS DE ESTUDO Um total de 120 participantes será incluído no estudo. Os participantes serão divididos igualmente em três grupos (grupo A, B e C). Os participantes do grupo A receberão colutório de clorexidina e os participantes do grupo B e C receberão 20% e 30% de extrato aquoso da fruta Morus alba, respectivamente.

ANÁLISE DE pH SALIVAR A análise do nível de pH salivar será feita usando medidor de pH e o pH salivar será registrado na linha de base e 15 dias após o uso do respectivo colutório.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Serão colhidos 5ml de amostras salivares não estimuladas dos participantes pela técnica de salivação passiva, em seguida, 3ml serão utilizados para medição do pH salivar e o restante da amostra salivar será armazenado a 0 C, e então será transferido para o laboratório para o avaliação de Streptococcus mutans. Após a coleta de amostras salivares de linha de base, os participantes serão solicitados a enxaguar e manter 10 ml do respectivo enxaguatório bucal por 30 segundos na boca antes de cuspi-lo. O procedimento será repetido pelos participantes, duas vezes ao dia, durante 15 dias. Após 15 dias, amostras de saliva serão coletadas novamente dos participantes para avaliação de Streptococcus mutans e os resultados obtidos serão comparados com amostras salivares basais para Streptococcus mutans.

PROCEDIMENTO DE CULTIVO A técnica para avaliação do conteúdo microbiano será o método de diluição e espalhamento em placa. A análise microbiana salivar será feita diluindo cada amostra salivar na proporção de 1:10 em água destilada. Cada amostra será então semeada em placa com meio de ágar Mitis salivarius (MSA). As placas serão então incubadas por 48 horas a 37°C e o número de colônias de Streptococcus mutans (CFU) será contado em microscópio binocular autoiluminado. Todas as descobertas serão registradas em proforma pré-concebidas. (Smariti sexena et al,. 2017, Velmurugan et al,. 2013, Hongkun Wu et al., 2003) ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados serão analisados ​​usando SPSS versão 23. A média e o desvio padrão serão considerados para dados numéricos. Frequência e porcentagens serão tomadas para dados categóricos.

Será feito o teste t pareado para comparação entre os valores pré e pós-intervenção das contagens bacterianas e valores de pH para cada grupo e a ANOVA com teste post hoc de Tukey será aplicado para comparação entre os três grupos. P < 0,05 será considerado estatisticamente significativo.

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS A aprovação ética será obtida do Comitê de Ética da Universidade de Ziauddin. O consentimento informado será obtido de cada sujeito antes do registro de qualquer medição. Todas as informações coletadas no estudo serão mantidas estritamente confidenciais. O anonimato de todos os sujeitos será mantido pelo armazenamento cuidadoso das informações. Se algum problema dentário for notado, os pacientes serão informados e encaminhados às clínicas relevantes para o tratamento necessário.

SIGNIFICADO DO ESTUDO Se os resultados do nosso estudo provarem que o Morus alba é mais eficaz, sendo derivado de uma fonte natural, um agente seguro, de baixo custo e ecologicamente correto estará disponível no futuro para a prevenção da cárie dentária. O Morus alba também pode ser usado para crianças e aqueles que não podem usar enxaguatórios bucais sintéticos devido a irritação, alteração do paladar, sensação de queimação e por motivos estéticos.

Morus alba, como outros produtos fitoterápicos, é ecologicamente correto e sua formulação como enxaguante bucal antimicrobiano ajuda a minimizar os efeitos tóxicos no meio ambiente produzidos pela clorexidina produzida quimicamente para enxaguatório bucal, que atualmente é o agente padrão-ouro para portadores dentários. Os resultados deste estudo podem abrir portas para outras pesquisas sobre outros produtos fitoterápicos tradicionalmente utilizados por seu potencial antimicrobiano.