EFFICACIA DEGLI ESTRATTI DI FRUTTI DI MORUS ALBA E DELLA CLOREXIDINA SU STREPTOCOCCUS MUTANS SALIVARE E LIVELLI DI pH

INTRODUZIONE Streptococcus mutans è il principale patogeno coinvolto nello sviluppo della carie dentale. Questo è un cocco gram-positivo anaerobico, naturalmente presente nel microbiota orale e può facilmente colonizzare sulla superficie del dente e avvia la produzione di acido combinando il polisaccaride extracellulare che provoca la demineralizzazione del dente e lo sviluppo della carie dentale (Shah et al., 2018) . La quantità di superfici colonizzate è associata a streptococcus mutans nella saliva. Pertanto, diminuendo la concentrazione di Streptococcus mutans nella cavità orale si avrebbe un vantaggio significativo nel ridurre la presenza di microbi cariogeni. (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas and Drake., 2018) La carie dentale è una malattia microbica del cavo orale, che si identifica mediante demineralizzazione delle sostanze inorganiche e dissoluzione delle sostanze organiche del denti. La carie dentale è stata riconosciuta nel corso della storia ed esiste in tutto il mondo, con una percentuale del 44%, ma la gravità e la prevalenza cambiano nei diversi paesi (J.V Soames e J.C Southam et al., 2018). Nei paesi vicini, la frequenza della carie dentale è piuttosto elevata, documentata rispettivamente al 68%, 65% e 64% in Cina, Iran e India. Anche la prevalenza della carie dentale in Pakistan è piuttosto elevata, circa il 62%, che è associata a significativa morbilità e conseguenze economiche (Reddy K S, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013). struttura del dente, gli zuccheri e il biofilm formati sulle superfici del dente (Pitts, N. B et al., 2016). Il processo di carie è composto da periodi alterni di demineralizzazione e rimineralizzazione del dente, che, se la demineralizzazione netta avviene in un tempo adeguato, provoca l'inizio della carie dentale. La causa della carie dentale è l'acido lattico prodotto dalla fermentazione degli zuccheri da parte dei batteri orali (Banas e Drake., 2018). Il normale livello di pH della saliva è 6,2-7,6. A pH neutro, gli ioni calcio e fosfato della saliva si incorporano nello smalto e mantengono la struttura dello smalto, ma quando il livello di pH scende al di sotto del normale, cioè a 5,5 o meno di 5,5, gli ioni calcio e fosfato dallo smalto fuoriescono e provocano lo scambio di ioni minerali dai cristalli di idrossiapatite dello smalto nella placca, con conseguente demineralizzazione del dente (J.V Soames Oral pathology 2018).

La gestione della carie dentale pone l'accento sulla riduzione della demineralizzazione dei denti modificando le abitudini alimentari, alterando o inibendo la crescita batterica, modificando il livello di pH salivare e la capacità tampone (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018). Diversi collutori sintetici antimicrobici, dentifrici, gel, gomme da masticare e vernici sono stati utilizzati per migliorare l'igiene della bocca e prevenire la carie dentale mirando ai microrganismi cariogeni. La prevenzione della carie dentale viene eseguita spazzolando la bocca dopo i pasti, utilizzando dentifrici al fluoro, collutori antimicrobici, ausili per la pulizia interdentale, stimolanti salivari (xilitolo, mannitolo), sigillanti per solchi e fessure e applicazione topica di fluoro sulle superfici dei denti. I collutori riducono anche l'infiammazione gengivale e inibiscono la formazione della placca (Velmurugan et al., 2013, Chen e Wang, 2010, Zajkani et al., 2018). I collutori hanno effetti anticariogeni, ma presentano alcuni svantaggi. Sono costosi, hanno effetti collaterali tra cui la colorazione dei denti e la sensazione di bruciore nella cavità orale (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018).

La clorexidina è il gold standard, l'approccio chimico comunemente usato e più efficace per ridurre l'accumulo di placca. È stato dimostrato che il risciacquo quotidiano della bocca con clorexidina (0,2%) riduce il tasso di crescita dello streptococco mutans nella cavità orale (Velmurugan et al., 2013). Tuttavia, ha alcuni effetti collaterali, ad esempio erosione della mucosa orale, gonfiore della parotide, colorazione dei denti, sensazione di bruciore e sapore amaro. (Jacob e Nivedhitha, 2018b, Shah et al., 2018, Van der Weijden et al., 2010, Nayak et al., 2012, Solderer et al., 2019) Molte popolazioni usano le piante medicinali come trattamenti tradizionali o alternativi per vari disturbi grazie ai loro migliori profili di sicurezza, effetti benefici per la salute, costi inferiori e facile reperibilità. Tra le specie vegetali utilizzate per scopi medicinali ci sono quelle del genere Morus, comprende le specie più comunemente utilizzate sono Morus alba, rubra e nigra, che hanno anche mostrato proprietà antimicrobiche contro varie infezioni potenzialmente letali (Ercisli S et al., 2006). Morus alba comunemente chiamato gelso bianco, e appartiene alla famiglia Moraceae è altrimenti chiamato Tut, shahtoot o gelso. Il Morus Alba (gelso bianco) è originario di Cina, India, Pakistan e Giappone (Kumar V et al., 2008). Nel presente studio, l'estratto di frutta di Morus alba sarà confrontato con la clorexidina con Streptococcus mutans contro i patogeni orali grazie alle sue proprietà antimicrobiche.

Dichiarazione del problema La carie dentale è molto diffusa in tutto il mondo, compreso il Pakistan; provoca perdita dei denti, malocclusione e problemi all'articolazione temporo-mandibolare. Le infezioni associate possono comportare il rischio di diffusione negli spazi fasciali superficiali e profondi e possono persino causare infezioni potenzialmente letali. Il trattamento della carie dentale è piuttosto costoso e rappresenta un onere economico per la nostra popolazione socioeconomica già povera. Pertanto, è necessario esplorare prodotti naturali che possano avere effetti antimicrobici e altri benefici per ridurre l'attività della carie insieme a buoni profili di sicurezza, facilmente disponibili ed economici.

Domanda di ricerca Gli estratti acquosi del frutto di Morus alba sono efficaci quanto il collutorio alla clorexidina per la prevenzione della carie dentale? Obiettivi Confrontare l'efficacia degli estratti del frutto di Morus alba con la clorexidina in pazienti affetti da carie dentale sulla base della riduzione della conta di Streptococcus mutans nella loro saliva.

Confrontare l'efficacia degli estratti di frutti di Morus alba con la clorexidina in pazienti affetti da carie dentale sulla base dell'aumento dei livelli di pH salivare.

Razionale La clorexidina è una sostanza chimica, ha un sapore amaro e provoca una sensazione di bruciore nella cavità orale e potrebbe non essere fattibile per i pazienti a causa di ragioni estetiche. Il collutorio derivato da prodotti erboristici, con attività antimicrobica contro i patogeni orali, potrebbe fornire un'opzione di trattamento economica e sicura per ridurre il carico della carie dentale nella nostra struttura clinica. Per quanto ne sappiamo, l'estratto di frutti di gelso non è stato valutato per la sua attività antimicrobica contro i patogeni orali, incluso lo Streptococcus mutans.

Ipotesi

Ipotesi nulla:

Ho: Gli estratti acquosi del frutto di Morus alba non sono altrettanto efficaci del collutorio alla clorexidina per la prevenzione della carie dentale.

Ipotesi alternativa:

Ha: gli estratti acquosi del frutto di Morus alba sono altrettanto efficaci del collutorio alla clorexidina per la prevenzione della carie dentale.

REVISIONE DELLA LETTERATURA La carie dentale è costituita da connessioni tra le strutture del dente, gli zuccheri e il biofilm microbico sulle superfici del dente (Pitts, N. B et al., 2016). Lo streptococco mutans e il pH salivare sono i due principali fattori che causano la carie dentale e quindi prenderli di mira può essere un percorso efficace per affrontare questa malattia globale. La clorexidina è un eccellente agente antimicrobico ed è considerato un vantaggio per il mantenimento della salute e dell'igiene orale. Allo stesso modo, sono stati introdotti molti agenti erboristici efficaci quanto la clorexidina. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob and Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017) Le piante medicinali sono state utilizzate da molte popolazioni come agenti terapeutici a causa della loro facile reperibilità, sicurezza ed economicità. Le specie morus hanno anche proprietà medicinali e sono state utilizzate come antidiabetici, neuroprotettivi, ipolipidimici e come lassativi (Anna Gryn-Rynko et al., 2016). Più di 100 specie di morus sono presenti in tutto il mondo e in Pakistan sono disponibili 25 specie di morus. Le specie di morus più comuni sono Morus alba, rubra e nigra (Imran M., Khan H., et al., 2010).

Il frutto di Morus alba contiene molte sostanze attive, come flavonoli, polifenoli, alcaloidi e polisaccaridi (Gundogdu M et al., 2011). Il Morus alba è una ricca fonte di vitamina A, vitamina B1, acido folico, vitamina C, minerali, carboidrati, amminoacidi, acidi grassi, antociani e saponine (Jiang Y et al., 2015).

Nella tradizionale medicina naturale cinese, il frutto del gelso è stato utilizzato nei farmaci umani per trattare il diabete, l'ipertensione, l'anemia e il dolore articolare. Morus alba è noto per le sue proprietà antidiabetiche, antielmintiche, antimicrobiche, ansiolitiche, epatoprotettive e nefroprotettive (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ). Il frutto di Morus, pur essendo della stessa specie, può contenere diverse proprietà antiossidanti oltre che diversa composizione chimica. Gli elementi minerali in Morus alba includono potassio (K), sodio (Na), fosforo (P), calcio (Ca), zinco (Zn), ferro (Fe), rame (Cu), manganese (Mn), selenio (Se ), magnesio (Mg), cromo (Cr) e arsenico (As) (Liang, L et al., 2012).

L'estratto metanolico della corteccia di Morus alba e dei suoi costituenti sono usati come agenti antimicrobici (Kuete, et al., 2009). L'agente antimicrobico "kuwanon G" ottenuto dalla corteccia della radice di Morus alba ha indicato attività contro Streptococcus mutans a una MIC di 8,0 μg/ml. Il test battericida del kuwanon G ha indicato che inattivava totalmente lo Streptococcus mutans alla concentrazione di 20 μg/ml in 60 secondi (Park, K. M et al., 2002).

Secondo Jha et al, ha valutato l'attività antimicrobica delle foglie di Morus alba (estratto acquoso) su batteri gram-positivi (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) e gram-negativi (Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli). I risultati dell'attività antimicrobica hanno confermato che Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli erano le specie batteriche più sensibili all'estratto grezzo, hanno mostrato il valore MIC a concentrazioni comprese tra 0,2 e 26 mg/mL (S. Jha, A.K et al., 2013).

È stata valutata l'attività antimicrobica dell'1-deoxynojirmiycin (componente delle foglie di Morus alba) e dell'estratto etanolico grezzo delle foglie di Morus alba. Sia la 1-deossinojirmiycina che le foglie di morus alba (estratto grezzo) hanno mostrato una forte attività batteriostatica contro Streptococcus mutans, ma la 1-deoxynojirmiycin ha mostrato un valore MIC inferiore (15,6 mg/ml) rispetto all'estratto grezzo di Morus alba (125 mg/mg/mL) ( B. Islam., et al 2008). L'estratto etanolico delle foglie di Morus alba ha mostrato attività antimicrobica contro Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida krusei, Candida albicans, Aspergillus flavus e Candida tropicalis (Oliveira et al., 2015).

Gli antociani sono il costituente più significativo del frutto di Morus alba, che sono composti fenolici responsabili di molte attività biologiche come proprietà antimicrobiche, antiossidanti, neuroprotettive e antinfiammatorie (Liu LK et al., 2008). La cianidina-3-glucoside e la cianidina-3-rutinoside sono le principali antocianine separate dal frutto del gelso (Suh H.J et al 2003, Liu X.et al 2004). Il principio attivo di Morus alba è l'antocianina e le antocianine presenti nel frutto delle specie Morus hanno mostrato attività antibatteriche contro E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (Chen H., et al 2017). I meccanismi proposti attraverso i quali l'antocianina produce effetti antimicrobici includono l'azione sulla membrana cellulare del patogeno con la fuoriuscita del suo acido nucleico e delle sue proteine ​​(Bajpai et al., 2013). L'antocianina causa l'inibizione della superossido dismutasi microbica, della fosfatasi alcalina e della produzione di ATP con successiva inibizione del ciclo TCA (Li et al., 2010). Tutti questi meccanismi provocano la lisi della cellula patogena.

Shumaila Naz et al. hanno confermato l'attività antimicrobica degli estratti di frutti di gelso contro i patogeni microbici presenti nell'acqua (Listeria monocytogene, Salmonella enterica, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Clostridium sp., Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Corneybacterium sp. ., Bacillus subtilis, , E. coli, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptococcus pyogenes, Actinomyces sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhi, Bacillus anthracis e Streptococcus pneumonia) isolati da diversi campioni di acqua. I risultati hanno indicato che gli estratti di frutti di gelso sono efficaci contro i patogeni microbici presenti nell'acqua (Shumaila Naz et al., 2018).

PROFILI DI SICUREZZA DEL MORUS ALBA La somministrazione intragastrica dell'estratto di Morus alba nei ratti per la durata di 7 giorni alla dose massima di 1gm/kg non ha prodotto effetti tossici (Jiao Y et al., 2017). Uno studio condotto sui ratti in cui gli effetti degli estratti etanolici di Morus alba nei ratti alla dose di 250mg/kg per 2 settimane di somministrazione non hanno provocato effetti tossici (Hwang et al., 2016). Un altro studio condotto su ratti nutriti con antociani derivati ​​dal frutto del gelso. Gli antociani hanno diminuito i livelli aumentati di aspartato aminotransferasi (AST) e alanina aminotransferasi ALT nei ratti. (Effetti epatoprotettivi) CALCOLO DELLA DIMENSIONE DEL CAMPIONE La dimensione del campione è stata stimata utilizzando il calcolatore della dimensione del campione Open Epi considerando le seguenti statistiche; Variazione del livello di pH (clorexidina) = 6,88±0,20 (Velmurugan et al., 2013) e considerando la differenza del 20% di pH per gli estratti di gelso come 8,256±0,24 Potenza del test= 90% Livello di confidenza= 95% La dimensione del campione calcolata è risultata pari a 1 in ciascun gruppo. Tuttavia, includerò 120 pazienti con 40 pazienti in ciascun gruppo in base all'ipotesi di normalità.

METODOLOGIA DELLA RICERCA Contesto dello studio Questo studio sarà condotto presso il dipartimento di Odontoiatria, Ospedale civile di Uthal, distretto di Lasbella e presso il dipartimento di Patologia vegetale, Lasbella University of Agriculture, Water and Marines Sciences (LUAWMS) Balochistan.

Disegno dello studio Trial clinico controllato randomizzato È uno studio in doppio cieco, in cui sia il ricercatore che il paziente saranno in cieco per mantenere i risultati imparziali. Tuttavia, il co-investigatore saprà che il paziente sta ricevendo il gold standard o un collutorio a base di erbe.

Durata dello studio La durata dello studio sarà compresa tra 6 mesi e 1 anno dopo l'approvazione dello studio da parte di RAC, ERC e BASR dell'Università di Ziauddin.

Tecnica di campionamento Per la selezione del campione verrà utilizzata una tecnica di campionamento consecutivo non probabilistico

Criteri di selezione Criteri di inclusione Tutti i pazienti di età compresa tra 18 e 40 anni con almeno 20 denti in bocca esclusi i denti del giudizio.

I pazienti di entrambi i sessi. I pazienti con lesioni cariose attive e non trattate (almeno un dente cariato deve essere presente nella cavità orale del paziente).

Criteri di esclusione I pazienti sottoposti a trattamento ortodontico I pazienti già in terapia antibiotica o collutorio antimicrobico. I pazienti con allergia al collutorio alla clorexidina I pazienti il ​​cui consenso non è stato ottenuto MATERIALI E METODO MATERIALI UTILIZZATI NELLO STUDIO I materiali utilizzati nello studio saranno collutorio alla clorexidina, frutto di Morus alba, pHmetro, agar selettivo e piastre di coltura per Streptococcus mutans, test tubi e kit per la raccolta della saliva.

COLLEZIONE MORUS ALBA Il frutto di Morus alba (gelso bianco) sarà ottenuto da un'autentica erboristeria e il frutto di Morus alba sarà autenticato dal dipartimento di botanica del LUAWMS.

PREPARAZIONE DELL'ESTRATTO ACQUOSO DEL FRUTTO DI MORUS ALBA La preparazione sarà effettuata presso il dipartimento di Patologia Vegetale LUAWMS. I frutti di Morus alba saranno lavati con acqua distillata e lasciati asciugare. Successivamente il materiale del frutto (Morus alba) verrà macinato con l'ausilio di mortaio e pestello. Per la preparazione acquosa al 20%, 100 ml di acqua distillata saranno aggiunti a 20 g di polvere macinata e saranno incubati in un incubatore con agitazione per 8 ore. (Per la preparazione acquosa al 30%, verranno aggiunti 100 ml di acqua distillata a 30 g di polvere macinata). Gli estratti acquosi saranno filtrati attraverso carta da filtro Watman No. 1 (Schuell e Schleicher 125 mm Cat No. 1001 125) (Shumaila naz et al., 2018).

STANDARDIZZAZIONE DEI PARTECIPANTI I soggetti selezionati in base ai criteri di inclusione saranno standardizzati. Ai partecipanti verrà consigliato di lavarsi i denti due volte al giorno (dopo colazione al mattino e prima di coricarsi) e di evitare cibi spazzatura. Ai partecipanti verrà consigliato di assumere bevande zuccherate (tè, caffè, bevande zuccherate) non più di 2 volte al giorno. Queste Istruzioni saranno consegnate anche ai partecipanti in forma scritta. I partecipanti saranno istruiti ad agire in base a questa guida e saranno chiamati dopo 1 settimana per campioni salivari di base.

PROCEDURA DI RACCOLTA DEI DATI Un totale di 120 pazienti che soddisfano i criteri di inclusione saranno arruolati nello studio. I consensi informati saranno presi da tutti i partecipanti. Durante l'acquisizione del consenso, i pazienti verranno informati che riceveranno il gold standard (clorexidina) o un collutorio a base di erbe. La selezione dei pazienti nel gruppo A, B o C sarà effettuata mediante il metodo della tabella dei numeri casuali. L'etichettatura del gruppo come A, B e C sarà effettuata dal co-ricercatore. L'elenco dei gruppi verrà sigillato in busta opaca e verrà aperto al termine dello studio.

GRUPPI DI STUDIO Un totale di 120 partecipanti saranno inclusi nello studio. I partecipanti saranno equamente divisi in tre gruppi (gruppo A, B e C). Ai partecipanti del gruppo A verrà somministrato un collutorio alla clorexidina e ai partecipanti del gruppo B e C verrà somministrato rispettivamente il 20% e il 30% di estratto acquoso del frutto di Morus alba.

ANALISI DEL pH SALIVARE L'analisi del livello del pH salivare verrà eseguita utilizzando il pHmetro e il pH salivare verrà registrato al basale e 15 giorni dopo l'uso del rispettivo collutorio.

PROCEDURA SPERIMENTALE I campioni salivari non stimolati al basale da 5 ml verranno prelevati dai partecipanti mediante tecnica di sbavatura passiva, quindi verranno utilizzati 3 ml per la misurazione del pH salivare e il campione salivare rimanente verrà conservato a 0 C, quindi verrà trasferito al laboratorio per il valutazione di Streptococcus mutans. Dopo aver prelevato campioni salivari di base, ai partecipanti verrà chiesto di risciacquare e tenere 10 ml del rispettivo collutorio per la durata di 30 secondi in bocca prima di sputarlo. La procedura sarà ripetuta dai partecipanti, due volte al giorno per 15 giorni. Dopo 15 giorni, i campioni salivari verranno nuovamente prelevati dai partecipanti per la valutazione di Streptococcus mutans e i risultati ottenuti saranno confrontati con i campioni salivari al basale per Streptococcus mutans.

PROCEDURA DI COLTURA La tecnica per valutare il contenuto microbico sarà il metodo della diluizione e diffusione su piastra. L'analisi microbica salivare sarà effettuata diluendo ogni campione salivare rapporto 1:10 in acqua distillata. Ogni campione verrà quindi strisciato su una piastra contenente Mitis salivarius agar media (MSA). Le piastre saranno quindi incubate per 48 ore a 37°C e il numero di colonie di Streptococcus mutans (CFU) sarà contato al microscopio binoculare autoilluminante. Tutti i risultati saranno registrati in una proforma pre-progettata. (Smariti sexena et al,. 2017, Velmurugan et al,. 2013, Hongkun Wu et al., 2003) ANALISI STATISTICA I dati saranno analizzati utilizzando SPSS versione 23. La media e la deviazione standard saranno prese per i dati numerici. La frequenza e le percentuali saranno prese per i dati categorici.

Verrà eseguito il test paired-t per il confronto tra i valori pre e post intervento delle conte batteriche e dei valori di pH per ciascun gruppo e verrà applicato l'ANOVA con il test di Tukey post hoc per il confronto tra i tre gruppi. P < 0,05 sarà considerato statisticamente significativo.

CONSIDERAZIONE ETICA L'approvazione etica sarà presa dal Comitato Etico dell'Università di Ziauddin. Il consenso informato sarà ottenuto da ciascun soggetto prima della registrazione di qualsiasi misurazione. Tutte le informazioni raccolte dallo studio saranno mantenute strettamente riservate. L'anonimato di tutti i soggetti sarà mantenuto mediante un'accurata conservazione delle informazioni. Se verranno rilevati problemi dentali, i pazienti verranno informati e indirizzati alle cliniche competenti per il trattamento necessario.

SIGNIFICATO DELLO STUDIO Se i risultati del nostro studio dimostrano che il Morus alba è più efficace, essendo derivato da fonti naturali, in futuro sarà disponibile un agente sicuro, economico ed ecologico per la prevenzione della carie dentale. Il Morus alba potrebbe essere utilizzato anche per i bambini e per coloro che non possono utilizzare collutori sintetici a causa di irritazioni, alterazione del gusto, sensazione di bruciore e per ragioni estetiche.

Morus alba come altri prodotti a base di erbe è ecologico e la sua formulazione come risciacquo orale antimicrobico aiuta a ridurre al minimo gli effetti tossici sull'ambiente prodotti dalla clorexidina per risciacquo orale prodotto chimicamente, che è attualmente l'agente gold standard per i trasporti dentali. I risultati di questo studio possono aprire le porte ad altre ricerche su altri prodotti erboristici tradizionalmente utilizzati per il loro potenziale antimicrobico.