桑白皮果实提取物和氯己定对唾液变异链球菌和 pH 水平的功效

引言 变形链球菌是与龋齿形成有关的主要病原体。 这是一种厌氧革兰氏阳性球菌，天然存在于口腔微生物群中，很容易在牙齿表面定植，并通过结合细胞外多糖开始产生酸，导致牙齿脱矿质和龋齿的发展（Shah 等人，2018 年） . 定植表面的数量与唾液中的变形链球菌有关。 因此，通过降低口腔中变形链球菌的浓度将在减少致龋微生物的发生方面具有显着优势。 (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas and Drake., 2018)牙齿。 龋齿在整个历史上都得到认可，并且存在于世界各地，据报道为 44%，但不同国家的严重程度和患病率有所不同（J.V Soames 和 J.C Southam 等人，2018 年）。 在我们的周边国家，龋齿发生率相当高，据记载中国、伊朗和印度分别为68%、65%和64%。 巴基斯坦的龋齿患病率也相当高，约为 62%，这与显着的发病率和经济后果有关（Reddy K S, et al., 2017, Lu Liu et al., 2013）牙齿结构、牙齿表面形成的糖和生物膜（Pitts, N. B et al., 2016）。 龋齿过程由牙齿脱矿质和再矿质化周期的改变组成，如果净脱矿质发生的时间足够长，就会导致龋齿的发生。 龋齿的原因是口腔细菌发酵糖类产生的乳酸（Banas and Drake., 2018）。 唾液的正常 pH 值是 6.2-7.6。 在中性 pH 值下，唾液中的钙离子和磷酸根离子会融入牙釉质并维持牙釉质的结构，但当 pH 值低于正常值时，即 5.5 或低于 5.5，牙釉质中的钙离子和磷酸根离子会渗出并导致矿物质离子从牙釉质的羟基磷灰石晶体交换到牙菌斑中，导致牙齿脱矿（J.V Soames Oral pathology 2018）。

龋齿管理强调通过改变饮食习惯、改变或抑制细菌生长、改变唾液 pH 值和缓冲能力来减少牙齿脱矿（Khirtika 等人，2017 年；Velmurugan 等人，2013 年；Yang 等人，2018 年）。 不同的抗菌合成漱口水、牙膏、凝胶、口香糖和清漆已被用于改善口腔卫生并通过针对致龋微生物来预防龋齿。 预防龋齿的方法是饭后刷牙，使用含氟牙膏、抗菌漱口水、牙间清洁剂、唾液兴奋剂（木糖醇、甘露醇）、窝沟封闭剂，以及在牙齿表面局部涂氟。 漱口水还可以减少牙龈炎症并抑制牙菌斑形成（Velmurugan 等人，2013 年；Chen 和 Wang，2010 年；Zajkani 等人，2018 年）。 漱口水有防龋作用，但也有一定的缺点。 它们价格昂贵，有副作用，包括牙齿染色和口腔灼烧感（Nayak 等人，2012 年；Aoun 等人，2018 年）。

洗必泰是减少牙菌斑积聚的金标准、常用且最有效的化学方法。 每天用洗必泰 (0.2%) 漱口已被证明可以降低口腔中变形链球菌的生长速度（Velmurugan 等人，2013 年）。 但它有一定的副作用，如口腔粘膜糜烂、腮腺肿胀、牙齿染色、灼热感和苦味。 （Jacob 和 Nivedhitha，2018b；Shah 等人，2018 年；Van der Weijden 等人，2010 年；Nayak 等人，2012 年；Solderer 等人，2019 年）许多人使用药用植物作为治疗各种疾病的传统或替代疗法由于它们具有更好的安全性、有益健康的效果、更低的成本和易于获得的特性。 在用于药用目的的植物物种中，有桑属植物，其中最常用的物种是桑属白桑、红桑和黑桑，它们还显示出抗各种危及生命的感染的抗菌特性（Ercisli S 等人，2006 年）。 桑白皮俗称白桑，属桑科，别称Tut、shahtoot或桑葚。 Morus Alba（白桑）原产于中国、印度、巴基斯坦和日本（Kumar V 等人，2008 年）。 在当前的研究中，由于其抗菌特性，桑白皮果实提取物将与洗必泰和变形链球菌对抗口腔病原体进行比较。

问题说明 龋齿在包括巴基斯坦在内的全球范围内非常普遍；它会导致牙齿脱落、咬合不正和颞下颌关节问题。 相关感染可能会扩散到浅层和深层筋膜空间，甚至可能导致危及生命的感染。 治疗龋齿非常昂贵，给我们已经贫困的低社会经济人口造成经济负担。 因此，需要探索可能具有抗菌和其他有益作用的天然产品，以减少龋齿活动以及良好的安全性、易于获得且具有成本效益。

研究问题 桑树果实的水提物在预防龋齿方面是否与洗必泰漱口水同样有效？ 目的 在减少龋齿患者唾液中变形链球菌数量的基础上，比较桑树果实提取物与洗必泰对龋齿患者的疗效。

比较桑树果实提取物与洗必泰在龋齿患者唾液 pH 值增加基础上的疗效。

基本原理 洗必泰是一种化学物质，具有苦味并在口腔中引起灼烧感，出于美容原因可能对患者不适用。 源自草药产品的漱口水对口腔病原体具有抗菌活性，可能会提供经济且安全的治疗选择，以减轻我们临床机构中龋齿的负担。 据我们所知，尚未评估桑葚提取物对口腔病原体（包括变异链球菌）的抗菌活性。

假设

零假设：

何：桑树果实的水提取物在预防龋齿方面不如洗必泰漱口水有效。

替代假设：

Ha：桑树果实的水提取物在预防龋齿方面与洗必泰漱口水同样有效。

文献综述 龋齿由牙齿结构、糖和牙齿表面的微生物生物膜之间的联系组成（Pitts, N. B 等人，2016 年）。 变形链球菌和唾液 pH 值是导致龋齿的两个主要因素，因此针对它们可能是解决这一全球疾病的有效途径。 洗必泰是一种出色的抗菌剂，被认为是维持口腔健康和卫生的福音。 同样，许多草药已被引入，它们与氯己定一样有效。 （Sajjan 等人，2016 年；Ahmed 等人，2017 年；Jacob 和 Nivedhitha，2018 年；Carounanidy 等人，2007 年；Esther 等人，2017 年）易于获得、安全且具有成本效益。 桑属植物还具有药用特性，已被用作抗糖尿病、神经保护、降血脂和泻药（Anna Gryn-Rynko 等人，2016 年）。 全世界有 100 多种桑属植物，巴基斯坦有 25 种桑属植物。 最常见的桑属物种是桑属白桑、红桑和黑桑（Imran M., Khan H., et al., 2010）。

桑树果实含有多种活性物质，如黄酮醇、多酚、生物碱和多糖（Gundogdu M 等，2011）。 桑白皮是维生素 A、维生素 B1、叶酸、维生素 C、矿物质、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、花青素和皂苷的丰富来源（Jiang Y 等人，2015 年）。

在传统的中国天然药物中，桑葚已被用于治疗糖尿病、高血压、贫血和关节痛的药物中。 桑白皮以其抗糖尿病、驱蠕虫、抗菌、抗焦虑、保肝和护肾等特性而闻名（Wang, J.；等人，2013 年；Yang, X. L 等人，2010 年；Khalid, S 等人，2017 年） ). 桑果虽然来自同一物种，但可能含有不同的抗氧化特性和不同的化学成分。 桑树中的矿物质元素包括钾（K）、钠（Na）、磷（P）、钙（Ca）、锌（Zn）、铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、硒（Se） )、镁 (Mg)、铬 (Cr) 和砷 (As)（Liang, L 等人，2012 年）。

桑树树皮的甲醇提取物及其成分被用作抗菌剂（Kuete 等人，2009 年）。 从桑树根的树皮中获得的抗微生物剂“kuwanon G”显示出对 Streptococcus mutans 的活性，MIC 为 8.0 μg/ml。 kuwanon G 的杀菌试验表明，它在 60 秒内以 20 μg/ml 的浓度完全灭活变形链球菌 (Park, K. M et al., 2002)。

根据 Jha 等人的说法，他评估了桑树叶（水提取物）对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草杆菌）和革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌和大肠杆菌）的抗菌活性。 抗菌活性结果证实，枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是对粗提物最敏感的菌种，显示浓度为 0.2-26mg/mL 的 MIC 值（S. Jha, A.K 等人，2013 年）。

评估了 1-deoxynojirmiycin（桑树叶的成分）和桑树叶粗乙醇提取物的抗菌活性。 1-deoxynojirmiycin 和桑白叶（粗提物）均对变形链球菌表现出很强的抑菌活性，但 1-deoxynojirmiycin 的 MIC 值（15.6mg/ml）低于桑白皮粗提物（125mg/mg/mL） （B. Islam., et al 2008）。 桑白叶的乙醇提取物对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、克柔念珠菌、白色念珠菌、黄曲霉和热带念珠菌具有抗菌活性（Oliveira 等人，2015 年）。

花青素是桑树果实中最重要的成分，它是酚类化合物，具有许多生物活性，例如抗菌、抗氧化、神经保护和抗炎特性（Liu LK 等人，2008 年）。 cyanidin-3-glucoside 和 cyanidin-3-rutinoside 是从桑葚中分离出来的主要花青素 (Suh H.J et al 2003, Liu X.et al 2004)。 桑白皮的活性成分是花青素，桑属植物果实中存在的花青素对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性（Chen H., et al 2017）。 花青素产生抗菌作用的拟议机制包括对病原体细胞膜的作用及其核酸和蛋白质的泄漏（Bajpai 等人，2013 年）。 花青素抑制微生物超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和 ATP 的产生，随后抑制 TCA 循环（Li 等人，2010）。所有这些机制都会导致致病细胞裂解。

Shumaila Naz 等人证实了桑葚提取物对水生微生物病原体（单核细胞增生李斯特菌、肠道沙门氏菌、卡他莫拉氏菌、嗜肺军团菌、藤黄微球菌、奇异变形杆菌、梭状芽孢杆菌、沙雷氏菌、嗜水气单胞菌、角杆菌属）的抗菌活性.，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，化脓性链球菌，放线菌，金黄色葡萄球菌，霍乱弧菌，伤寒杆菌，炭疽杆菌和肺炎链球菌）从不同的水样中分离出来。 结果表明，桑葚提取物可有效对抗水生微生物病原体（Shumaila Naz 等人，2018 年）。

桑白皮的安全性概况 以最大剂量 1gm/kg 对大鼠连续 7 天灌胃桑白皮提取物未产生毒性作用（Jiao Y 等人，2017 年）。 对大鼠进行的一项研究表明，桑树乙醇提取物以 250 毫克/千克的剂量给药 2 周，未引起毒性作用（Hwang 等人，2016 年）。 另一项针对喂食桑葚花青素的大鼠进行的研究。 花青素可降低大鼠体内升高的天冬氨酸转氨酶 (AST) 和丙氨酸转氨酶 ALT 水平。 (保肝作用) 样本量计算样本量是使用Open Epi样本量计算器通过考虑以下统计来估计的； pH 值变化（洗必泰）= 6.88±0.20（Velmurugan 等人，2013 年）并考虑到桑葚提取物 20% 的 pH 值差异为 8.256±0.24 检验能力= 90% 置信水平= 95% 计算得出的样本量为每组 1。 但是，根据正态性假设，我将包括 120 名患者，每组 40 名患者。

研究方法 研究环境 本研究将在拉斯贝拉区拉斯贝拉市乌塔尔民用医院牙科系和俾路支省拉斯贝拉农业、水和海洋科学大学 (LUAWMS) 植物病理学系进行。

研究设计 随机对照临床试验 这是一项双盲研究，研究人员和患者都将被蒙蔽，以保持结果的公正性。 然而，共同研究者将知道患者正在接受金标准或草药漱口水。

学习期限 经Ziauddin 大学RAC、ERC 和BASR 批准学习后，学习期限为6 个月至1 年。

抽样技术 样本选择将采用非概率连续抽样技术

选择标准 纳入标准 年龄在18-40岁之间的所有患者，口腔中至少有20颗牙齿，不包括智齿。

任何性别的患者。 有活跃的和未经治疗的龋齿病变的患者，（患者口腔中至少应存在一颗龋齿）。

排除标准 正在接受正畸治疗的患者 已经接受抗生素治疗或抗菌冲洗的患者。 对洗必泰漱口水过敏的患者 无法获得同意的患者 材料和方法 研究中使用的材料 研究中使用的材料将是洗必泰漱口水、桑白皮果实、pH 计、选择性琼脂和变异链球菌培养板、试验试管和唾液收集套件。

MORUS ALBA COLLECTION 桑​​白皮（白桑葚）果实将从一家正宗的草药商店获得，桑白皮果实将通过 LUAWMS 植物学部门的认证。

桑树果实水提取物的制备 该制备将在 LUAWMS 植物病理学系完成。 桑树果实将用蒸馏水洗涤并晾干。 然后用研钵和研杵研磨水果材料（桑白皮）。 对于20%的水性制剂，将100ml蒸馏水加入到20g磨碎的粉末中，在振荡培养箱中孵育8小时。 （30%水性制剂，30g研磨粉加100ml蒸馏水）。 水提取物将通过 Watman No. 1（Schuell and Schleicher 125 mm Cat No. 1001 125）滤纸（Shumaila naz 等人，2018）过滤。

参与者的标准化根据纳入标准选择的受试者将被标准化。 建议参与者每天刷牙两次（早上早餐后和就寝时间），并避免垃圾食品。 建议参与者每天饮用含糖饮料（茶、咖啡、加糖饮料）不超过 2 次。 这些说明也将以书面形式提供给参与者。 参与者将被指示根据该指南采取行动，并将在 1 周后被要求获取基线唾液样本。

数据收集程序 总共 120 名符合纳入标准的患者将被纳入研究。 将从所有参与者处获得知情同意。 在征得同意后，患者将被告知他们将接受金标准（氯己定）或草药漱口水。 A、B 或 C 组患者的选择将通过随机数字表方法完成。 组的标记为 A、B 和 C 将由共同研究者完成。 小组名单将密封在不透明的信封中，并在研究完成时打开。

研究组 本研究将包括总共 120 名参与者。 参赛者将平均分为三组（A组、B组和C组）。 A 组的参与者将接受洗必泰漱口水，B 组和 C 组的参与者将分别接受 20% 和 30% 的桑树果实水提取物。

唾液 pH 值分析 将使用 pH 计进行唾液 pH 值分析，并在基线和使用相应漱口水后 15 天记录唾液 pH 值。

实验步骤 5ml 基线未刺激唾液样本将通过被动流口水技术从参与者身上采集，然后 3ml 将用于测量唾液 pH 值，剩余唾液样本将在 0 C 下储存，然后将转移到实验室用于变异链球菌的评估。 在采集基线唾液样本后，参与者将被要求漱口并在吐出前将 10 毫升的相应漱口水含在嘴里 30 秒。 参与者将重复该程序，每天两次，持续 15 天。 15 天后，将再次从参与者身上采集唾液样本以评估变异链球菌，并将获得的结果与变异链球菌的基线唾液样本进行比较。

培养程序 评估微生物含量的技术是稀释和铺板法。 唾液微生物分析将通过在蒸馏水中以 1:10 的比例稀释每个唾液样品来进行。 然后将每个样品划线到具有 Mitis salivarius 琼脂培养基 (MSA) 的平板中。 然后将板在 37°C 下孵育 48 小时，并在自发光双目显微镜下计算变形链球菌菌落 (CFU) 的数量。 所有调查结果都将记录在预先设计的形式中。 (Smarti sexena 等人，。 2017 年，Velmurugan 等人。 2013, Hongkun Wu et al., 2003) STATISTICAL ANALYSIS 数据将使用 SPSS 23 版进行分析。 数值数据将采用平均值和标准偏差。 频率和百分比将用于分类数据。

将进行配对 t 检验以比较每组的细菌计数和 pH 值的干预前后值，并且将应用具有事后 Tukey 检验的 ANOVA 来进行三组之间的比较。 P < 0.05 将被认为具有统计学意义。

伦理考虑 伦理批准将由 Ziauddin 大学伦理委员会进行。 在记录任何测量之前，将获得每个受试者的知情同意。 从研究中收集的所有信息都将严格保密。 所有主题的匿名将通过仔细存储信息来维护。 如果发现任何与牙齿有关的问题，则会通知患者并转介到相关诊所进行必要的治疗。

研究的意义 如果我们的研究结果证明桑白皮更有效，那么从天然来源提取的桑白皮安全、低成本和环保剂将在未来用于预防龋齿。 桑树也可用于儿童和因刺激、味觉改变、烧灼感和美容原因而不能使用合成漱口水的人。

桑白皮与其他草药产品一样是环保的，其作为抗菌漱口水的配方有助于最大限度地减少化学生产的漱口水洗必泰对环境产生的毒性影响，洗必泰目前是牙科治疗的黄金标准。 这项研究的结果可能会为其他传统上用于抗菌潜力的草药产品的其他研究打开大门。