ÚČINNOST VÝTAŽKŮ OVOCE MORUS ALBA A CHLORHEXIDINU NA SLINNÉ STREPTOKOKY A ÚROVNĚ pH

ÚVOD Streptococcus mutans je hlavním patogenem, který se podílí na vzniku zubního kazu. Jedná se o anaerobní grampozitivní kok, který se přirozeně vyskytuje v ústní mikrobiotě a může se snadno kolonizovat na povrchu zubu a iniciuje produkci kyseliny spojením extracelulárního polysacharidu, což má za následek demineralizaci zubu a vznik zubního kazu (Shah et al., 2018) . Množství kolonizovaných povrchů je spojeno se streptokokem mutans ve slinách. Snížení koncentrace Streptococcus mutans v ústní dutině by tedy mělo významnou výhodu ve snížení výskytu kariogenních mikrobů. (Lemos et al., 2019, Forssten et al., 2010, Banas and Drake., 2018) Zubní kaz je mikrobiální onemocnění dutiny ústní, které je identifikováno demineralizací anorganických látek a rozpouštěním organických látek v dutině ústní. zuby. Zubní kaz byl uznáván v průběhu historie a existuje po celém světě, uvádí se, že je 44 %, ale závažnost a prevalence se v různých zemích mění (J.V Soames a J.C Southam et al., 2018). V našich sousedních zemích je frekvence zubního kazu poměrně vysoká, v Číně je to 68 %, 65 % a 64 % v Íránu a Indii. Prevalence zubního kazu v Pákistánu je také poměrně vysoká, kolem 62 %, což je spojeno s významnou nemocností a ekonomickými důsledky (Reddy K. S., et al., 2017, Lu Liu et al., 2013) Zubní kaz v podstatě zahrnuje kontakt mezi struktura zubu, cukry a biofilm vytvořené na povrchu zubů (Pitts, N. B et al., 2016). Proces zubního kazu složený ze střídání period demineralizace a remineralizace zubu, který, pokud dojde k čisté demineralizaci po přiměřenou dobu, vede k iniciaci zubního kazu. Příčinou zubního kazu je kyselina mléčná produkovaná fermentací cukrů ústními bakteriemi (Banas a Drake., 2018). Normální hodnota pH slin je 6,2-7,6. Při neutrálním pH se vápníkové a fosfátové ionty ze slin zabudovávají do skloviny a udržují strukturu skloviny, ale když hladina pH klesne pod normální, tj. při 5,5 nebo pod 5,5, ionty vápníku a fosfátu ze skloviny se vyplavují a způsobují výměna minerálních iontů z hydroxyapatitových krystalů skloviny do plaku, což vede k demineralizaci zubu (J.V Soames Oral pathology 2018).

Léčba zubního kazu klade důraz na snížení demineralizace zubů změnou stravovacích návyků, změnou nebo inhibicí růstu bakterií, změnou hladiny pH slin a pufrační kapacity (Khirtika et al., 2017, Velmurugan et al., 2013, Yang et al., 2018). Různé antimikrobiální syntetické ústní vody, zubní pasty, gely, žvýkačky a laky byly použity ke zlepšení ústní hygieny a prevenci zubního kazu zaměřením na kariogenní mikroorganismy. Prevence zubního kazu se provádí čištěním úst po jídle, používáním fluoridových zubních past, antimikrobiálních ústních vod, pomůcek na čištění mezizubních prostor, stimulantů slin (xylitol, mannitol), tmelů pro pečetění důlků a fisur a aplikací fluoridu na povrch zubů. Ústní výplachy také snižují zánět dásní a inhibují tvorbu plaku (Velmurugan et al., 2013, Chen a Wang, 2010, Zajkani et al., 2018). Ústní vody mají antikariogenní účinky, ale mají určité nevýhody. Jsou nákladné, mají vedlejší účinky včetně barvení zubů a pocitu pálení v dutině ústní (Nayak et al., 2012, Aoun et al., 2018).

Chlorhexidin je zlatý standard, běžně používaný a nejúčinnější chemický přístup ke snížení hromadění plaku. Bylo prokázáno, že každodenní vyplachování úst chlorhexidinem (0,2 %) snižuje rychlost růstu streptokoka mutans v dutině ústní (Velmurugan et al., 2013). Má však určité vedlejší účinky, např. erozi sliznice dutiny ústní, otok příušních žláz, barvení zubů, pocit pálení a hořkou chuť. (Jacob a Nivedhitha, 2018b, Shah a kol., 2018, Van der Weijden a kol., 2010, Nayak a kol., 2012, Solderer a kol., 2019) Mnoho populací používá léčivé rostliny jako tradiční nebo alternativní léčbu různých onemocnění. díky lepším bezpečnostním profilům, zdraví prospěšným účinkům, nižší ceně a snadné dostupnosti. Mezi rostlinné druhy používané pro léčebné účely patří ty z rodu Morus, mezi nejběžněji používané druhy patří Morus alba, rubra a nigra, které také prokázaly antimikrobiální vlastnosti proti různým život ohrožujícím infekcím (Ercisli S et al., 2006). Morus alba běžně nazývaný jako bílá moruše a patří do čeledi Moraceae se jinak nazývá Tut, shahtoot nebo moruše. Morus Alba (moruše bílá) pochází z Číny, Indie, Pákistánu a Japonska (Kumar V et al., 2008). V této studii bude extrakt z plodů Morus alba srovnáván s chlorhexidinem se Streptococcus mutans proti orálním patogenům kvůli jeho antimikrobiálním vlastnostem.

Prohlášení o problému Zubní kaz je vysoce rozšířený po celém světě včetně Pákistánu; způsobuje ztrátu zubů, malokluzi a problémy s temporomandibulárním kloubem. Přidružené infekce mohou nést riziko šíření do povrchových a hlubokých fasciálních prostor a mohou dokonce způsobit život ohrožující infekce. Léčba zubního kazu je poměrně nákladná a představuje ekonomickou zátěž pro naši již tak deprivovanou nízkou socioekonomickou populaci. Existuje tedy potřeba prozkoumat přírodní produkty, které mohou mít antimikrobiální a další příznivé účinky na snížení aktivity zubního kazu spolu s dobrými bezpečnostními profily, snadno dostupnými a nákladově efektivními.

Výzkumná otázka Jsou vodné extrakty z plodů Morus alba stejně účinné jako ústní voda chlorhexidin v prevenci zubního kazu? Cíle Porovnat účinnost extraktů z plodů Morus alba s chlorhexidinem u pacientů se zubním kazem na základě snížení počtu Streptococcus mutans v jejich slinách.

Porovnat účinnost extraktů z plodů Morus alba s chlorhexidinem u pacientů se zubním kazem na základě zvýšení pH ve slinách.

Odůvodnění Chlorhexidin je chemická látka, která má hořkou chuť a způsobuje pocit pálení v dutině ústní a pro pacienty nemusí být z kosmetických důvodů proveditelná. Ústní voda získaná z rostlinných produktů s antimikrobiální aktivitou proti orálním patogenům může poskytnout ekonomickou a bezpečnou možnost léčby ke snížení zátěže zubního kazu v našem klinickém uspořádání. Podle našich nejlepších znalostí nebyl extrakt z plodů moruše hodnocen na svou antimikrobiální aktivitu proti orálním patogenům včetně Streptococcus mutans.

Hypotéza

Nulová hypotéza:

Ho: Vodné výtažky z plodů Morus alba nejsou při prevenci zubního kazu stejně účinné jako ústní voda chlorhexidin.

Alternativní hypotéza:

Ha: Vodné výtažky z plodů Morus alba jsou stejně účinné jako ústní voda chlorhexidin pro prevenci zubního kazu.

PŘEHLED LITERATURY Zubní kaz se skládá ze spojení mezi zubními strukturami, cukry a mikrobiálním biofilmem na povrchu zubů (Pitts, N. B et al., 2016). Streptococcus mutans a pH slin jsou dva hlavní faktory, které způsobují zubní kaz, a proto jejich zacílení může být účinnou cestou k řešení tohoto globálního onemocnění. Chlorhexidin je vynikající antimikrobiální látka a je považována za přínos pro udržení zdraví a hygieny ústní dutiny. Podobně bylo zavedeno mnoho rostlinných látek, které jsou stejně účinné jako chlorhexidin. (Sajjan et al., 2016, Ahmed et al., 2017, Jacob a Nivedhitha, 2018, Carounanidy et al., 2007, Esther et al., 2017) Léčivé rostliny byly používány mnoha populacemi jako terapeutické činidlo kvůli jejich snadná dostupnost, bezpečnost a hospodárnost. Druh morus má také léčivé vlastnosti a byl používán jako antidiabetikum, neuroprotektivum, hypolipidimikum a jako laxativa (Anna Gryn-Rynko et al., 2016). Více než 100 druhů morusů je přítomno po celém světě a v Pákistánu je k dispozici 25 druhů morus. Nejběžnější druhy morus jsou Morus alba, rubra a nigra (Imran M., Khan H., et al., 2010).

Plody Morus alba obsahují mnoho účinných látek, jako jsou flavonoly, polyfenoly, alkaloidy a polysacharidy (Gundogdu M et al., 2011). Morus alba je bohatým zdrojem vitamínu A, vitamínu B1, kyseliny listové, vitamínu C, minerálů, sacharidů, aminokyselin, mastných kyselin, anthokyanů a saponinů (Jiang Y et al., 2015).

V konvenční čínské přírodní medicíně byly plody moruše využívány v lidových lécích k léčbě cukrovky, hypertenze, anémie a bolesti kloubů. Morus alba je známý pro své antidiabetické, antihelmintické, antimikrobiální, anxiolytické, hepatoprotektivní a nefroprotektivní vlastnosti (Wang, J.; et al., 2013, Yang, X. L et al., 2010, Khalid, S et al., 2017 ). Plody Morus, ačkoli ze stejného druhu, mohou obsahovat různé antioxidační vlastnosti a také různé chemické složení. Mezi minerální prvky v Morus alba patří draslík (K), sodík (Na), fosfor (P), vápník (Ca), zinek (Zn), železo (Fe), měď (Cu), mangan (Mn), selen (Se). ), hořčík (Mg), chrom (Cr) a arsen (As) (Liang, L et al., 2012).

Metanolový extrakt z kůry Morus alba a jeho složky se používají jako antimikrobiální látky (Kuete, et al., 2009). Antimikrobiální látka "kuwanon G" získaná z kůry kořene Morus alba vykazuje aktivitu proti Streptococcus mutans při MIC 8,0 μg/ml. Baktericidní test kuwanonu G ukázal, že zcela inaktivoval Streptococcus mutans v koncentraci 20 μg/ml za 60 sekund (Park, K. M et al., 2002).

Podle Jha et al hodnotil antimikrobiální aktivitu listů Morus alba (vodný extrakt) na grampozitivní (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) a gramnegativní bakterie (Pseudomonas aeruginosa a Escherichia coli). Výsledky antimikrobiální aktivity potvrdily, že Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus a Escherichia coli byly nejcitlivějšími bakteriálními druhy na surový extrakt, vykazovaly hodnotu MIC v koncentraci od 0,2 do 26 mg/ml (S. Jha, A.K a kol., 2013).

Byla hodnocena antimikrobiální aktivita 1-deoxynojirmiycinu (složka listů Morus alba) a surového ethanolického extraktu listů Morus alba. Listy 1-deoxynojirmiycinu i morus alba (surový extrakt) vykazovaly silnou bakteriostatickou aktivitu proti Streptococcus mutans, ale 1-deoxynojirmiycin vykazoval nižší hodnotu MIC (15,6 mg/ml) než surový extrakt z Morus alba (125 mg/mg/ml). (B. Islam., et al 2008). Etanolový extrakt z listů Morus alba vykazoval antimikrobiální aktivitu proti Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida krusei, Candida albicans, Aspergillus flavus a Candida tropicalis (Oliveira et al., 2015).

Antokyany jsou nejvýznamnější složkou ovoce Morus alba, což jsou fenolické sloučeniny, které jsou zodpovědné za mnoho biologických aktivit, jako jsou antimikrobiální, antioxidační, neuroprotektivní a protizánětlivé vlastnosti (Liu LK et al., 2008). Kyanidin-3-glukosid a kyanidin-3-rutinosid jsou hlavní antokyany oddělené z plodů moruše (Suh H.J et al 2003, Liu X. et al 2004). Aktivní složkou Morus alba je antokyan a anthokyan přítomný v plodech druhu Morus vykazující antibakteriální účinky proti E. coli, Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus (Chen H., et al 2017). Mezi navrhované mechanismy, kterými antokyanin vyvolává antimikrobiální účinky, patří působení na buněčnou membránu patogenu s únikem jeho nukleové kyseliny a proteinů (Bajpai et al., 2013). Antokyanin způsobuje inhibici mikrobiální superoxiddismutázy, alkalické fosfatázy a produkce ATP s následnou inhibicí cyklu TCA (Li et al., 2010). Všechny tyto mechanismy vedou k lýze patogenní buňky.

Shumaila Naz et al potvrdili antimikrobiální aktivitu extraktů z plodů moruše proti mikrobiálním patogenům přenášeným vodou (Listeria monocytogene, Salmonella enteric, Moraxella catarrhalis, Legionella pneumophila, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Clostridium sp., Serratia sp., Cormonas hydrophila sp. Bacillus subtilis, E. coli, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptococcus pyogenes, Actinomyces sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhi, Bacillus anthracis a Streptococcus pneumonia) izolovaných z různých vzorků vody. Výsledky ukázaly, že extrakty z plodů moruše jsou účinné proti mikrobiálním patogenům přenášeným vodou (Shumaila Naz et al., 2018).

BEZPEČNOSTNÍ PROFILY MORUS ALBA Intragastrické podávání extraktu Morus alba u potkanů ​​po dobu 7 dnů v maximální dávce 1gm/kg nevyvolalo toxické účinky (Jiao Y et al., 2017). Studie provedená na potkanech, ve kterých účinky etanolových extraktů Morus alba u potkanů ​​v dávce 250 mg/kg po dobu 2 týdnů podávání nevyvolaly toxické účinky (Hwang et al., 2016). Další studie provedená na krysách, které byly krmeny anthokyany získanými z plodů moruše. Anthokyany snížily zvýšené hladiny aspartátaminotransferázy (AST) a alaninaminotransferázy ALT u potkanů. (Hepatoprotektivní účinky) VÝPOČET VELIKOSTI VZORKU Velikost vzorku byla odhadnuta pomocí kalkulačky velikosti vzorku Open Epi s ohledem na následující statistiky; Změna hladiny pH (chlorhexidin) = 6,88±0,20 (Velmurugan et al., 2013) a 20% rozdíl v pH pro extrakty z moruše je považován za 8,256±0,24 Síla testu = 90 % Úroveň spolehlivosti = 95 % Vypočítaná velikost vzorku vyšla jako 1 v každé skupině. Zahrnu však 120 pacientů, kteří mají 40 pacientů v každé skupině podle předpokladu normality.

METODOLOGIE VÝZKUMU Nastavení studie Tato studie bude provedena na katedře zubního lékařství, civilní nemocnice Uthal, okres Lasbella a na katedře rostlinné patologie, Lasbella University of Agriculture, Water and Marines Sciences (LUAWMS) Balochistan.

Návrh studie Randomizovaná kontrolovaná klinická studie Jde o dvojitě zaslepenou studii, ve které budou jak výzkumník, tak pacient zaslepeni, aby výsledky zůstaly nezkreslené. Spoluřešitel však bude vědět, že buď pacient dostává zlatý standard nebo bylinnou ústní vodu.

Délka studie Doba trvání studie bude 6 měsíců až 1 rok po schválení studie od RAC, ERC a BASR univerzity Ziauddin.

Technika vzorkování Pro výběr vzorku bude použita technika nepravděpodobného konsekutivního vzorkování

Kritéria výběru Kritéria pro zařazení Všichni pacienti ve věku 18-40 let mají v ústech alespoň 20 zubů bez zubů moudrosti.

Pacienti obou pohlaví. Pacienti s aktivními a neléčenými kariézními lézemi (v ústní dutině pacienta by měl být přítomen alespoň jeden kariézní zub).

Kritéria vyloučení Pacienti podstupující ortodontickou léčbu Pacienti, kteří již užívají antibiotickou terapii nebo antimikrobiální výplach. Pacienti s alergií na ústní vodu chlorhexidin Pacienti, jejichž souhlas se nepodařilo získat MATERIÁLY A METODA MATERIÁLY POUŽITÉ VE STUDII Materiály použité ve studii budou ústní voda chlorhexidin, plod Morus alba, pH metr, selektivní agar a kultivační misky pro Streptococcus mutans, test sady zkumavek a slin.

KOLEKCE MORUS ALBA Plody Morus alba (Moruše bílá) budou získány z autentického obchodu s bylinkami a plody Morus alba budou ověřeny z oddělení botaniky LUAWMS.

PŘÍPRAVA VODNÉHO EXTRAKTU Z OVOCE MORUS ALBA Příprava bude provedena na oddělení rostlinné patologie LUAWMS. Ovoce Morus alba se omyje destilovanou vodou a nechá se oschnout. Poté se ovocná hmota (Morus alba) rozdrtí pomocí hmoždíře. Pro 20% vodný přípravek se 100 ml destilované vody přidá k 20 g mletého prášku a inkubuje se v třepacím inkubátoru po dobu 8 hodin. (Pro 30% vodnou přípravu se 100 ml destilované vody přidá ke 30 g mletého prášku). Vodné extrakty budou filtrovány přes filtrační papír Watman č. 1 (Schuell a Schleicher 125 mm kat. č. 1001 125) (Shumaila naz et al., 2018).

STANDARDIZACE ÚČASTNÍKŮ Subjekty vybrané podle kritérií pro zařazení budou standardizovány. Účastníkům bude doporučeno, aby si čistili zuby dvakrát denně (ráno po snídani a před spaním) a vyhýbali se nezdravým jídlům. Účastníkům bude doporučeno konzumovat slazené nápoje (čaj, káva, slazený nápoj) maximálně 2x denně. Tyto Pokyny budou účastníkům předány rovněž v písemné podobě. Účastníci budou instruováni, aby se řídili tímto návodem, a po 1 týdnu budou vyzváni k odběru základních vzorků slin.

POSTUP SBĚRU DAT Do studie bude zařazeno celkem 120 pacientů splňujících kritéria pro zařazení. Od všech účastníků budou odebrány informované souhlasy. Při přijímání souhlasu budou pacienti informováni, že dostanou buď zlatý standard (chlorhexidin) nebo bylinnou ústní vodu. Výběr pacientů ve skupině A, B nebo C bude proveden metodou tabulky náhodných čísel. Označení skupiny jako A, B a C provede spoluřešitel. Seznam skupin bude zapečetěn v neprůhledné obálce a bude otevřen po dokončení studie.

STUDIJNÍ SKUPINY Do studie bude zařazeno celkem 120 účastníků. Účastníci budou rovnoměrně rozděleni do tří skupin (skupina A, B a C). Účastníci skupiny A dostanou ústní vodu Chlorhexidin a účastníci skupiny B a C 20% a 30% vodný extrakt z plodů Morus alba.

ANALÝZA pH SLIN Analýza hladiny pH slin bude provedena pomocí pH metru a pH slin bude zaznamenáno na začátku a 15 dní po použití příslušné ústní vody.

EXPERIMENTÁLNÍ POSTUP Účastníkům se odeberou základní nestimulované vzorky slin o objemu 5 ml pomocí techniky pasivního slintání, poté se 3 ml použijí pro měření pH slin a zbývající vzorek slin se uloží při 0 °C a poté se přenese do laboratoře na vyšetření. hodnocení Streptococcus mutans. Po odebrání základních vzorků slin budou účastníci požádáni, aby si vypláchli a podrželi 10 ml příslušné ústní vody po dobu 30 sekund v ústech, než ji vyplivnou. Procedura bude účastníky opakována, dvakrát denně po dobu 15 dnů. Po 15 dnech budou účastníkům znovu odebrány vzorky slin pro posouzení Streptococcus mutans a získané výsledky budou porovnány se základními vzorky slin pro Streptococcus mutans.

KULTIVAČNÍ POSTUP Technikou pro hodnocení mikrobiálního obsahu bude metoda ředění a rozprostření. Mikrobiální analýza slin bude provedena zředěním každého vzorku slin v poměru 1:10 v destilované vodě. Každý vzorek se poté nanese na plotnu s agarovým médiem Mitis salivarius (MSA). Destičky budou poté inkubovány po dobu 48 hodin při 37 °C a počet kolonií Streptococcus mutans (CFU) bude spočítán pod samosvítícím binokulárním mikroskopem. Všechny nálezy budou zaznamenány do předem navrženého proforma. (Smariti sexena a kol. 2017, Velmurugan a kol. 2013, Hongkun Wu et al., 2003) STATISTICKÁ ANALÝZA Data budou analyzována pomocí SPSS verze 23. Pro numerická data se použije průměr a standardní odchylka. Pro kategorická data se použije frekvence a procenta.

Pro srovnání mezi hodnotami počtu bakterií před a po intervenci a hodnotami pH pro každou skupinu bude proveden párový t test a pro srovnání mezi třemi skupinami se použije ANOVA s post hoc Tukeyho testem. P < 0,05 bude považováno za statisticky významné.

ETICKÉ ÚVAHY Etické schválení bude převzato od Etické komise Ziauddin University. Před záznamem jakéhokoli měření bude od každého subjektu získán informovaný souhlas. Veškeré informace shromážděné ze studie budou přísně důvěrné. Pečlivým uchováváním informací bude zachována anonymita všech subjektů. Pokud budou zaznamenány jakékoli problémy související se zuby, budou pacienti informováni a odesláni na příslušné kliniky k nezbytnému ošetření.

VÝZNAM STUDIE Pokud výsledky naší studie prokážou, že Morus alba je účinnější, pak bude v budoucnu dostupný bezpečný, levný a ekologický prostředek pro prevenci zubního kazu, který pochází z přírodního zdroje. Morus alba lze použít i pro děti a ty, kteří nemohou používat syntetické ústní vody pro podráždění, změnu chuti, pálení a z kosmetických důvodů.

Morus alba je stejně jako ostatní rostlinné produkty šetrné k životnímu prostředí a jeho složení jako antimikrobiální ústní voda pomáhá minimalizovat toxické účinky na životní prostředí, které produkuje chemicky vyráběná ústní voda chlorhexidin, což je v současnosti zlatý standard pro zubní nosiče. Výsledky této studie mohou otevřít dveře pro další výzkumy jiných rostlinných produktů tradičně používaných pro jejich antimikrobiální potenciál.