肝疾患の組織モデル (TIMOLD)

これは前臨床研究プロジェクトであり、患者の介入は予定されていません。 このプロジェクトでは、根治手術中に廃棄された匿名化された人体組織サンプルを利用します。 このプロジェクトに含まれる肝臓部分サンプルは、レスター総合病院の HPB ユニットで肝臓病変の待機手術を受けている患者からのものになります。 24 の肝臓セグメントのサンプル サイズは検出力計算によって決定されており、過去数年間に待機的肝臓手術によって実際に切除された肝臓の数と一致しています。 この研究およびサンプルの使用による手術手順や募集結果に変更はありません。 肝臓サンプルに対して行われたすべての実験作業は患者に影響を与えません。

実験には、生体外の臓器セグメントの灌流および細菌またはウイルスによる感染が含まれます。 灌流された 24 個の肝臓セグメントの生検は、in vitro 組織切片およびマクロファージ細胞培養のために処理されます。 得られた初代細胞培養物と組織切片は、将来の研究のために冷凍保存されます。 肝臓の 24 の部分、およびそれらに由来する組織および細胞に関するすべての in vitro 研究では、侵入した細菌またはウイルスを除去する肝細胞の能力に対する治療介入 (抗体、受容体拮抗薬、抗生物質およびその他の分子) の効果を評価します。 実験は肝臓サンプルが入手可能になるたびに実行されます。

ヒト組織の保存と廃棄の戦略を含む実験戦略の詳細な技術的説明は次のとおりです。

1. 肝臓部分の体外灌流: この作業は、臓器を安定化し、臓器に感染させ、その後、そこから初代細胞培養用の組織切片と細胞を抽出するために行われます。 我々は、正常体温のex vivoブタ肝臓灌流モデルのセットアップに成功しました。 この専門知識により、最大 24 時間にわたるブタ肝臓の臓器収集、輸送、灌流のパラメーターを定義し、重要な感染モデルを開発することができました。 感染により、血液から細菌を除去する能力と良好な濾過能力が保存されていることが示され、この応用には不可欠であり、全器官モデルにおいてもマクロファージの特定のサブセットが細菌の細胞内複製を許容していることが示された。 この実験シリーズでは、外移植されたヒト肝臓セグメントを灌流することを提案します。 ブタとは対照的に、獲得免疫を中和または最小限に抑えるために、ヒト臓器合成培地の灌流に使用します。 組織学、共焦点顕微鏡検査、FACS 分析、細菌およびウイルスの計数が、灌流臓器を分析するための主な方法論となります。 研究のこの部分の目的は、器官レベルで細菌やウイルスが肝臓組織のマクロファージで複製できることを実証し、侵襲性の細菌やウイルス疾患を潜在的に予防するこれらの初期段階の予防に抗感染症治療の焦点を当てることである。 灌流された 24 個の臓器セグメントからのサンプルは、組織切片培養および初代細胞培養のソースとなります。
2. 初代培養細胞: 24 個のヒト肝臓切片から、ヒト組織マクロファージおよびその他の免疫細胞の初代培養用のサンプルを採取します。 マウスやブタの細胞に使用されている方法論を使用して、ヒト肝免疫細胞、特にマクロファージの初代培養をセットアップします。 マクロファージや好中球などの免疫細胞は、パーコール勾配遠心分離、FACS、磁気分離などのさまざまな方法で精製され、最長 7 日間培養されます。 培養物は、サイトカイン、表面マーカー、任意の生産および遺伝子発現を含む複数のパラメーターについてテストされます。 細菌またはウイルスとの相互作用をテストするには、培養細胞を一連の細菌およびウイルス病原体に感染させます。 他の方法論では、共焦点顕微鏡、FACS、RNAseq が細菌およびウイルスの病原体と宿主細胞の挙動を監視するために使用されます。 システムの扱いやすさをテストするために、サイトカイン、ケモカイン、薬物、抗生物質、その他の化合物による介入が実行されます。 臓器の遺伝子型解析は行われません。 介入の対象を特定することを念頭に置いて、細胞培養モデルは、制御されたインビトロ培養系における細菌またはウイルスと免疫細胞、特に組織マクロファージとの相互作用の詳細な定量化可能なパラメーターを提供することを目的としています。 これは、浸潤性疾患の開始を変更する戦略をテストするための中スループットアッセイの設計を可能にすることを目的としています。 細胞はさらなる研究のために液体窒素中で保存されます。
3. 器官型スライス培養: 24 個のヒト肝臓切片から、細胞に加えて、器官型スライス培養用の組織サンプルも抽出します。 脳スライス用に適切に設定され、肝臓について説明された方法論を使用して、器官型ヒト肝臓スライス培養物を培養します。 これらの臓器切片は、臓器の多細胞空間微細構造を維持するため、細胞培養よりも優れており、これは組織マクロファージを分析する場合に特に重要です。 脳スライス培養に関しては、スライスを細菌またはウイルス病原体で感染させ、組織内でのそれらの移動、細胞の感染、および単一の宿主細胞の反応を監視します。 組織切片培養の使用により、マクロファージを含む免疫細胞の特定のサブセットの標的化および複製許容性の性質を具体的に研究できるはずである。 この目的の目標は、感染した肝臓スライスのタイムラップ共焦点顕微鏡法を含む、肝臓内の感染病巣の詳細な発達を可能にすることです。 このモデルにおけるサイトカインおよび他の宿主由来分子の試験により、マクロファージを含む免疫細胞の特定のサブセットを標的とする介入の可能性が示されることが期待される。 組織切片はさらなる研究のために液体窒素中で保存されます。