Gewebemodelle für Lebererkrankungen (TIMOLD)

Es handelt sich um ein präklinisches Forschungsprojekt und es ist kein Eingriff am Patienten geplant. Das Projekt nutzt anonymisierte menschliche Gewebeproben, die bei radikalen Operationen weggeworfen werden. Die in diesem Projekt enthaltenen Lebersegmentproben stammen von Patienten, die sich in der HPB-Abteilung des Leicester General Hospital einer elektiven Operation wegen einer Leberläsion unterziehen. Die Probengröße von 24 Lebersegmenten wurde durch Leistungsberechnungen ermittelt und steht im Einklang mit der Anzahl der Lebern, die in den letzten Jahren tatsächlich durch elektive Leberoperationen entfernt wurden. Keine Änderung des chirurgischen Eingriffs oder der Rekrutierungsergebnisse dieser Studie und der Verwendung der Proben. Alle an den Leberproben durchgeführten experimentellen Arbeiten haben keine Auswirkungen auf den Patienten.

Zu den Experimenten gehören die Ex-vivo-Perfusion von Organsegmenten und die Infektion mit Bakterien oder Viren. Biopsien der perfundierten 24 Lebersegmente werden für die In-vitro-Gewebeschnitt- und Makrophagenzellkultur verarbeitet. Die resultierenden primären Zellkulturen und Gewebeschnitte werden für zukünftige Forschungen eingefroren gelagert. Alle In-vitro-Studien an den 24 Lebersegmenten und den daraus abgeleiteten Geweben und Zellen werden die Wirkung therapeutischer Interventionen (Antikörper, Rezeptorantagonisten, Antibiotika und andere Moleküle) auf die Fähigkeit von Leberzellen bewerten, invasive Bakterien oder Viren zu beseitigen. Die Experimente werden immer dann durchgeführt, wenn eine Leberprobe verfügbar ist.

Die detaillierte technische Beschreibung der experimentellen Strategie einschließlich der Strategie zur Lagerung und Entsorgung des menschlichen Gewebes lautet wie folgt:

1. Ex-vivo-Perfusion des Lebersegments: Diese Arbeit wird durchgeführt, um das Organ zu stabilisieren, das Organ zu infizieren und daraus dann Gewebeschnitte und Zellen für die primäre Zellkultur zu gewinnen. Wir haben erfolgreich ein normothermes Ex-vivo-Perfusionsmodell für Schweineleber aufgebaut. Dieses Fachwissen ermöglichte es uns, die Parameter für die Organentnahme, den Transport und die Perfusion von Schweinelebern für bis zu 24 Stunden zu definieren und vor allem ein Infektionsmodell zu entwickeln. Bei der Infektion zeigte sich die Beibehaltung der Fähigkeit, Bakterien aus dem Blut zu entfernen, sowie eine gute Filterkapazität und, was für diese Anwendung wesentlich ist, dass auch im Gesamtorganmodell bestimmte Untergruppen von Makrophagen die intrazelluläre Replikation von Bakterien zulassen. In dieser Versuchsreihe schlagen wir vor, explantierte menschliche Lebersegmente zu perfundieren. Im Gegensatz zu Schweinen werden wir zur Perfusion des menschlichen Organs synthetische Medien verwenden, um erworbene Immunität zu neutralisieren oder zu minimieren. Histologie, konfokale Mikroskopie, FACS-Analyse sowie Bakterien- und Viruszählung werden die wichtigsten Methoden zur Analyse des durchbluteten Organs sein. Das Ziel dieses Teils der Arbeit besteht darin, zu zeigen, dass Bakterien und Viren auf Organebene in der Lage sind, sich in Makrophagen des Lebergewebes zu vermehren, und den Schwerpunkt antiinfektiver Behandlungen auf die Verhinderung dieser frühen Schritte zu lenken, die potenziell invasive bakterielle und virale Erkrankungen verhindern können. Proben aus den 24 durchbluteten Organsegmenten werden als Quelle für Gewebeschnittkulturen und primäre Zellkulturen dienen.
2. Primäre Zellkulturen: Aus den 24 menschlichen Lebersegmenten werden wir Proben für die Primärkultur menschlicher Gewebemakrophagen und anderer Immunzellen gewinnen. Mit der für Zellen von Mäusen und Schweinen verwendeten Methodik werden wir Primärkulturen menschlicher hepatischer Immunzellen und insbesondere Makrophagen anlegen. Immunzellen, einschließlich Makrophagen und Neutrophile, werden mit verschiedenen Methoden gereinigt, darunter Percoll-Gradientenzentrifugation, FACS und magnetische Trennung, und bis zu sieben Tage lang kultiviert. Die Kulturen werden auf mehrere Parameter getestet, darunter Zytokine, Oberflächenmarker, irgendjemand-Produktion und Genexpression. Um die Interaktion mit Bakterien oder Viren zu testen, werden die kultivierten Zellen mit einer Reihe bakterieller und viraler Krankheitserreger infiziert. Andere Methoden wie konfokale Mikroskopie, FACS und RNAseq werden zur Überwachung des Verhaltens von bakteriellen und viralen Krankheitserregern und Wirtszellen eingesetzt. Es werden Interventionen mit Zytokinen, Chemokinen, Medikamenten, Antibiotika und anderen Verbindungen durchgeführt, um die Beherrschbarkeit des Systems zu testen. Es wird keine Genotypisierung des Organs durchgeführt. Mit dem Ziel, Angriffspunkte zu identifizieren, sollen die Zellkulturmodelle detaillierte quantifizierbare Parameter der Interaktion von Bakterien bzw. Viren und Immunzellen, insbesondere Gewebemakrophagen, in einem kontrollierten In-vitro-Kultursystem liefern. Dies soll die Entwicklung von Assays mit mittlerem Durchsatz ermöglichen, um Strategien zu testen, die die Auslösung invasiver Krankheiten modifizieren. Für die weitere Forschung werden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
3. Organotypische Schnittkulturen: Aus den 24 menschlichen Lebersegmenten werden wir neben Zellen auch Gewebeproben für organotypische Schnittkulturen gewinnen. Mit der für Gehirnschnitte gut etablierten und für Leber beschriebenen Methodik werden wir organotypische menschliche Leberschnittkulturen kultivieren. Diese Organschnitte sind Zellkulturen überlegen, da sie die vielzellige räumliche Mikroarchitektur des Organs erhalten, was besonders wichtig bei der Analyse von Gewebemakrophagen ist. Bei Hirnschnittkulturen infizieren wir die Schnitte mit bakteriellen oder viralen Krankheitserregern und überwachen deren Wanderung innerhalb des Gewebes, die Infektion von Zellen und die Reaktion der einzelnen Wirtszellen. Die Verwendung von Gewebeschnittkulturen sollte es ermöglichen, die Targeting- und Replikationspermissivität bestimmter Untergruppen von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, gezielt zu untersuchen. Ein Ziel des Ziels besteht darin, eine detaillierte Entwicklung von Infektionsherden in der Leber zu ermöglichen, einschließlich konfokaler Zeitraffermikroskopie infizierter Leberschnitte. Das Testen von Zytokinen und anderen vom Wirt abgeleiteten Molekülen in diesem Modell soll das Potenzial von Interventionen aufzeigen, die auf bestimmte Untergruppen von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, abzielen. Zur weiteren Forschung werden Gewebeschnitte in flüssigem Stickstoff gelagert.