Weefselmodellen voor leverziekte (TIMOLD)

Dit is een preklinisch onderzoeksproject en er is geen tussenkomst van de patiënt gepland. Het project maakt gebruik van geanonimiseerde menselijke weefselmonsters die zijn weggegooid tijdens radicale chirurgie. De leversegmentmonsters die in dit project worden opgenomen, zullen afkomstig zijn van patiënten die een electieve operatie ondergaan voor een laesie in de lever in de HPB-eenheid van het Leicester General Hospital. De steekproefomvang van 24 leversegmenten is bepaald door powerberekeningen en komt overeen met het aantal levers dat daadwerkelijk is verwijderd door electieve leverchirurgie in de afgelopen jaren. Geen verandering in de chirurgische procedure of rekruteringsresultaten van deze studie en het gebruik van de monsters. Al het experimentele werk dat aan de levermonsters wordt uitgevoerd, zal geen effect hebben op de patiënt.

Experimenten omvatten ex vivo perfusie van orgaansegmenten en infectie met bacteriën of virussen. Biopsieën van de geperfundeerde 24 leversegmenten worden verwerkt voor in vitro weefselplakjes en macrofaagcelkweek. De resulterende primaire celculturen en weefselplakjes worden ingevroren bewaard voor toekomstig onderzoek. Alle in-vitro-onderzoeken van de 24 leversegmenten en de weefsels en cellen die daarvan zijn afgeleid, zullen het effect evalueren van therapeutische interventies (antilichamen, receptorantagonisten, antibiotica en andere moleculen) op het vermogen van levercellen om invasieve bacteriën of virussen te verwijderen. De experimenten worden telkens uitgevoerd als er een levermonster beschikbaar is.

De gedetailleerde technische beschrijving van de experimentele strategie, inclusief de strategie voor opslag en verwijdering van het menselijk weefsel, is als volgt:

1. Ex vivo perfusie van het leversegment: dit werk wordt gedaan om het orgaan te stabiliseren, het orgaan te infecteren en er vervolgens weefselplakjes en cellen uit te halen voor primaire celkweek. We hebben met succes een normothermisch ex vivo varkensleverperfusiemodel opgezet. Deze expertise stelde ons in staat om de parameters voor orgaanverzameling, transport en perfusie van varkenslevers gedurende maximaal vierentwintig uur te definiëren en, belangrijker nog, een infectiemodel te ontwikkelen. Infectie toonde behoud van het vermogen om bacteriën uit bloed te verwijderen en een goede filtercapaciteit en, essentieel voor deze toepassing, dat ook in het gehele orgaanmodel specifieke subsets van macrofagen tolerant zijn voor bacteriële intracellulaire replicatie. In deze experimentele serie stellen we voor om geëxplanteerde menselijke leversegmenten te perfuseren. In tegenstelling tot varkens zullen we voor perfusie van het menselijk orgaan synthetisch medium gebruiken om verworven immuniteit te neutraliseren of te minimaliseren. Histologie, confocale microscopie, FACS-analyse en bacteriële en virale telling zullen de belangrijkste methoden zijn om het geperfuseerde orgaan te analyseren. Het doel van dit deel van het werk is om aan te tonen dat bacteriën en virussen op orgaanniveau in staat zijn zich te vermenigvuldigen in leverweefselmacrofagen, waardoor de aandacht van anti-infectieuze behandelingen wordt gericht op het voorkomen van deze vroege stappen die mogelijk invasieve bacteriële en virale ziekten voorkomen. Monsters van de 24 geperfundeerde orgaansegmenten zullen de bron zijn van weefselplakculturen en primaire celculturen.
2. Primaire celculturen: Van de 24 menselijke leversegmenten zullen we monsters afleiden voor primaire kweek van macrofagen van menselijk weefsel en andere immuuncellen. Gebruikmakend van de methodologie die gebruikt wordt voor cellen van muizen en varkens, zullen we primaire culturen opzetten van menselijke leverimmuuncellen en in het bijzonder macrofagen. Immuuncellen, inclusief macrofagen en neutrofielen, zullen worden gezuiverd met behulp van verschillende methoden, waaronder percoll-gradiëntcentrifugatie, FACS en magnetische scheiding, en gedurende maximaal zeven dagen worden gekweekt. Culturen zullen worden getest op meerdere parameters, waaronder cytokines, oppervlaktemarkers, willekeurige productie en genexpressie. Om de interactie met bacteriën of virussen te testen, worden de gekweekte cellen geïnfecteerd met een panel van bacteriële en virale pathogenen. Bij andere methoden zullen confocale microscopie, FACS en RNAseq worden gebruikt om het gedrag van bacteriële en virale pathogenen en gastheercellen te monitoren. Interventies met cytokines, chemokines, medicijnen, antibiotica en andere verbindingen zullen worden uitgevoerd om de traceerbaarheid van het systeem te testen. Er zal geen genotypering van het orgaan worden uitgevoerd. Met het doel doelen voor interventie te identificeren, zijn de celkweekmodellen bedoeld om gedetailleerde kwantificeerbare parameters te bieden van de interactie van bacteriën of virussen en immuuncellen, in het bijzonder weefselmacrofagen, in een gecontroleerd in vitro kweeksysteem. Dit is bedoeld om het ontwerp van medium-throughput assays mogelijk te maken om strategieën te testen die de initiatie van invasieve ziekten wijzigen. Cellen worden voor verder onderzoek in vloeibare stikstof bewaard.
3. Organotypische schijfjesculturen: Van de 24 humane leversegmenten zullen we naast cellen ook weefselstalen afleiden voor organotypische schijfjesculturen. Met de methodologie goed opgezet voor hersenplakjes en beschreven voor lever, zullen we organotypische menselijke leverplakculturen kweken. Deze orgelplakjes zijn superieur aan celculturen, omdat ze de meercellige ruimtelijke microarchitectuur van het orgel behouden, wat vooral belangrijk is bij het analyseren van weefselmacrofagen. Wat betreft hersenschijfculturen, we zullen de plakjes infecteren met bacteriële of virale pathogenen en hun migratie binnen het weefsel, de infectie van cellen en de reactie van de afzonderlijke gastheercellen volgen. Het gebruik van weefselplakcultuur zou het mogelijk moeten maken om specifiek de gerichtheid en replicatie-permissieve aard van specifieke subsets van immuuncellen, waaronder macrofagen, te bestuderen. Een doel van het doel is om gedetailleerde ontwikkeling van infectieuze foci in de lever mogelijk te maken, inclusief time-lapses confocale microscopie van geïnfecteerde leverplakjes. Het testen in dit model van cytokines en andere van de gastheer afgeleide moleculen zal naar verwachting het potentieel aantonen van interventies gericht op specifieke subsets van immuuncellen, waaronder macrofagen. Weefselplakjes worden bewaard in vloeibare stikstof voor verder onderzoek.