Modelli di tessuto per malattie del fegato (TIMOLD)

Si tratta di un progetto di ricerca preclinica e non è previsto alcun intervento da parte del paziente. Il progetto utilizza campioni di tessuto umano anonimizzati scartati durante la chirurgia radicale. I campioni di segmenti epatici inclusi in questo progetto proverranno da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva per una lesione epatica nell'unità HPB del Leicester General Hospital. La dimensione del campione di 24 segmenti epatici è stata determinata mediante calcoli di potenza ed è in linea con il numero di fegati effettivamente rimossi dalla chirurgia epatica elettiva negli ultimi anni. Nessun cambiamento nella procedura chirurgica o nei risultati del reclutamento da questo studio e dall'uso dei campioni. Tutto il lavoro sperimentale svolto sui campioni di fegato non avrà alcun effetto sul paziente.

Gli esperimenti includono la perfusione di segmenti di organi ex vivo e l'infezione con batteri o virus. Le biopsie dei 24 segmenti epatici perfusi vengono elaborate per la fetta di tessuto in vitro e la coltura cellulare dei macrofagi. Le colture cellulari primarie risultanti e le fette di tessuto saranno conservate congelate per ricerche future. Tutti gli studi in vitro sui 24 segmenti epatici, e sui tessuti e le cellule da essi derivati, valuteranno l'effetto degli interventi terapeutici (anticorpi, antagonisti dei recettori, antibiotici e altre molecole) sulla capacità delle cellule epatiche di eliminare batteri o virus invasivi. Gli esperimenti verranno eseguiti ogni volta che sarà disponibile un campione di fegato.

La descrizione tecnica dettagliata della strategia sperimentale, compresa la strategia per lo stoccaggio e l'eliminazione del tessuto umano, sarà la seguente:

1. Perfusione ex vivo del segmento epatico: questo lavoro viene svolto per stabilizzare l'organo, infettare l'organo e quindi derivare da esso fette di tessuto e cellule per la coltura cellulare primaria. Abbiamo allestito con successo un modello di perfusione del fegato suino normo-termico ex vivo. Questa competenza ci ha permesso di definire i parametri per la raccolta, il trasporto e la perfusione degli organi di fegati suini fino a ventiquattro ore e, soprattutto, lo sviluppo e il modello di infezione. L'infezione ha mostrato la conservazione della capacità di rimuovere i batteri dal sangue e una buona capacità di filtraggio e, essenziale per questa applicazione, che anche nell'intero modello di organo specifici sottoinsiemi di macrofagi sono permissivi alla replicazione intracellulare batterica. In questa serie sperimentale proponiamo di perfondere segmenti di fegato umano espiantati. A differenza dei maiali, utilizzeremo per la perfusione il mezzo sintetico dell'organo umano al fine di neutralizzare o minimizzare l'immunità acquisita. Istologia, microscopia confocale, analisi FACS ed enumerazione batterica e virale saranno le principali metodologie per analizzare l'organo perfuso. Lo scopo di questa parte del lavoro è dimostrare che a livello di organo batteri e virus sono in grado di replicarsi nei macrofagi del tessuto epatico, focalizzando l'attenzione dei trattamenti anti-infettivi sulla prevenzione di questi primi passaggi potenzialmente prevenendo malattie batteriche e virali invasive. I campioni dei 24 segmenti di organi perfusi saranno la fonte di colture di fette di tessuto e colture di cellule primarie.
2. Colture cellulari primarie: dai 24 segmenti di fegato umano ricaveremo campioni per la coltura primaria di macrofagi tissutali umani e altre cellule immunitarie. Utilizzando la metodologia in uso per le cellule di topo e maiale, allestiremo colture primarie di cellule immunitarie epatiche umane ed in particolare di macrofagi. Le cellule immunitarie, inclusi macrofagi e neutrofili, saranno purificate con diverse metodologie, tra cui centrifugazione in gradiente di percoll, FACS e separazione magnetica e coltivate per un massimo di sette giorni. Le colture saranno testate per molteplici parametri tra cui citochine, marcatori di superficie, produzione di chiunque ed espressione genica. Per testare l'interazione con batteri o virus, le cellule in coltura saranno infettate con un pannello di agenti patogeni batterici e virali. Oltre ad altre metodologie, microscopia confocale, FACS e RNAseq saranno utilizzati per monitorare il comportamento di patogeni batterici e virali e cellule ospiti. Verranno effettuati interventi con citochine, chemochine, farmaci, antibiotici e altri composti per testare la trattabilità del sistema. Non verrà eseguita alcuna genotipizzazione dell'organo. Con l'obiettivo di identificare gli obiettivi per l'intervento, i modelli di coltura cellulare hanno lo scopo di fornire parametri quantificabili dettagliati dell'interazione di batteri o virus e cellule immunitarie in particolari macrofagi tissutali in un sistema di coltura in vitro controllato. Ciò ha lo scopo di consentire la progettazione di saggi a medio rendimento per testare strategie che modificano l'inizio della malattia invasiva. Le cellule saranno conservate in azoto liquido per ulteriori ricerche.
3. Colture di fettine organotipiche: Dai 24 segmenti di fegato umano ricaveremo, oltre alle cellule, anche campioni di tessuto per colture di fettine organotipiche. Con la metodologia ben messa a punto per fettine di cervello e descritta per il fegato, coltiveremo colture organotipiche di fettine di fegato umano. Queste fette di organo sono superiori alle colture cellulari, poiché mantengono la microarchitettura spaziale multicellulare dell'organo, che è particolarmente importante quando si analizzano i macrofagi tissutali. Per quanto riguarda le colture di fettine di cervello, infetteremo le fettine con agenti patogeni batterici o virali e monitoreremo la loro migrazione all'interno del tessuto, l'infezione delle cellule e la reazione delle singole cellule ospiti. L'uso della coltura di fette di tessuto dovrebbe consentire di studiare in modo specifico il targeting e la natura permissiva alla replicazione di specifici sottoinsiemi di cellule immunitarie, inclusi i macrofagi. Un obiettivo dell'obiettivo è consentire lo sviluppo dettagliato di focolai infettivi nel fegato, inclusa la microscopia confocale a intervalli di tempo di fette di fegato infette. I test in questo modello di citochine e altre molecole derivate dall'ospite dovrebbero mostrare il potenziale di interventi mirati a specifici sottoinsiemi di cellule immunitarie, compresi i macrofagi. Le fette di tessuto saranno conservate in azoto liquido per ulteriori ricerche.