Tkáňové modely pro onemocnění jater (TIMOLD)

Jedná se o předklinický výzkumný projekt a není plánován žádný zásah pacienta. Projekt využívá anonymizované vzorky lidské tkáně vyřazené během radikální operace. Vzorky jaterních segmentů zahrnuté v tomto projektu budou od pacientů podstupujících elektivní operaci jaterní léze na HPB jednotce Leicester General Hospital. Velikost vzorku 24 segmentů jater byla stanovena pomocí výpočtů výkonu a je v souladu s počtem jater skutečně odstraněných elektivní operací jater v posledních letech. Žádná změna v chirurgickém postupu nebo náboru výsledků z této studie a použití vzorků. Veškerá experimentální práce provedená na vzorcích jater nebude mít na pacienta žádný vliv.

Experimenty zahrnují ex vivo perfuzi segmentu orgánu a infekci bakteriemi nebo viry. Biopsie perfundovaných 24 jaterních segmentů se zpracují pro in vitro tkáňové řezy a kultivaci makrofágových buněk. Výsledné primární buněčné kultury a tkáňové řezy budou uloženy zmrazené pro budoucí výzkum. Všechny studie in vitro na 24 jaterních segmentech a tkáních a buňkách z nich odvozených vyhodnotí účinek terapeutických intervencí (protilátky, antagonisté receptorů, antibiotika a další molekuly) na schopnost jaterních buněk eliminovat invazivní bakterie nebo viry. Pokusy budou prováděny pokaždé, když bude k dispozici vzorek jater.

Podrobný technický popis experimentální strategie včetně strategie skladování a likvidace lidské tkáně bude následující:

1. Perfuze jaterního segmentu ex vivo: Tato práce se provádí za účelem stabilizace orgánu, infikování orgánu a následného získání tkáňových řezů a buněk pro primární buněčnou kulturu. Úspěšně jsme vytvořili normotermický ex vivo model perfuze prasečích jater. Tato odbornost nám umožnila definovat parametry pro odběr orgánů, transport a perfuzi prasečích jater po dobu až 24 hodin a především vyvinout a infekční model. Infekce prokázala zachování schopnosti odstraňovat bakterie z krve a dobrou filtrační kapacitu a podstatné pro tuto aplikaci, že také v celém orgánovém modelu jsou specifické podskupiny makrofágů permisivní pro bakteriální intracelulární replikaci. V této experimentální sérii navrhujeme perfuzi explantovaných segmentů lidských jater. Na rozdíl od prasat použijeme k perfuzi syntetické médium pro lidský orgán za účelem neutralizace nebo minimalizace získané imunity. Histologie, konfokální mikroskopie, FACS analýza a bakteriální a virové počítání budou hlavními metodikami analýzy perfundovaného orgánu. Cílem této části práce je demonstrovat, že na orgánové úrovni jsou bakterie a viry schopny replikovat se v makrofázích jaterní tkáně, přičemž pozornost antiinfekční léčby je zaměřena na prevenci těchto časných kroků potenciálně zabraňujících invazivním bakteriálním a virovým onemocněním. Vzorky z 24 perfundovaných segmentů orgánů budou zdrojem kultur tkáňových řezů a primárních buněčných kultur.
2. Primární buněčné kultury: Z 24 lidských jaterních segmentů odvodíme vzorky pro primární kultivaci lidských tkáňových makrofágů a dalších imunitních buněk. Pomocí metodiky používané pro buňky z myší a prasat vytvoříme primární kultury lidských jaterních imunitních buněk a zejména makrofágů. Imunitní buňky včetně makrofágů a neutrofilů budou purifikovány různými metodologiemi včetně centrifugace v gradientu percoll, FACS a magnetické separace a kultivovány po dobu až sedmi dnů. Kultury budou testovány na různé parametry včetně cytokinů, povrchových markerů, produkce kohokoli a genové exprese. Pro testování interakce s bakteriemi nebo viry budou kultivované buňky infikovány panelem bakteriálních a virových patogenů. Na základě jiné metodiky bude využita konfokální mikroskopie, FACS a RNAseq k monitorování chování bakteriálních a virových patogenů a hostitelských buněk. Budou provedeny intervence s cytokiny, chemokiny, léky, antibiotiky a dalšími sloučeninami, aby se otestovala ovladatelnost systému. Nebude provedena genotypizace orgánu. S cílem identifikovat cíle pro intervenci jsou modely buněčných kultur zamýšleny tak, aby poskytovaly podrobné kvantifikovatelné parametry interakce bakterií nebo virů a imunitních buněk v konkrétních tkáňových makrofázích v kontrolovaném kultivačním systému in vitro. To má umožnit návrh středně výkonných testů pro testování strategií modifikujících zahájení invazivního onemocnění. Pro další výzkum budou buňky uloženy v kapalném dusíku.
3. Organotypické řezové kultury: Z 24 lidských jaterních segmentů získáme kromě buněk také tkáňové vzorky pro organotypické řezové kultury. S metodikou dobře nastavenou pro mozkové řezy a popsanou pro játra budeme kultivovat organotypické kultury lidských jaterních řezů. Tyto plátky orgánů jsou lepší než buněčné kultury, protože zachovávají mnohobuněčnou prostorovou mikroarchitekturu orgánu, což je zvláště důležité při analýze tkáňových makrofágů. Pokud jde o kultury mozkových řezů, budeme řezy infikovat bakteriálními nebo virovými patogeny a sledovat jejich migraci v tkáni, infekci buněk a reakci jednotlivých hostitelských buněk. Použití kultury tkáňových řezů by mělo umožnit specificky studovat zacílení a replikaci-permisivní povahu specifických podskupin imunitních buněk včetně makrofágů. Cílem cíle je umožnit detailní vývoj infekčních ložisek v játrech včetně časosběrné konfokální mikroskopie infikovaných jaterních řezů. Očekává se, že testování v tomto modelu cytokinů a dalších molekul odvozených od hostitele ukáže potenciál intervencí zaměřených na specifické podskupiny imunitních buněk včetně makrofágů. Tkáňové řezy budou uloženy v kapalném dusíku pro další výzkum.