Modelos de tecidos para doenças hepáticas (TIMOLD)

Este é um projeto de pesquisa pré-clínica e nenhuma intervenção no paciente está planejada. O projeto faz uso de amostras anônimas de tecido humano descartadas durante uma cirurgia radical. As amostras de segmentos hepáticos incluídas neste projeto serão de pacientes submetidos a cirurgia eletiva para uma lesão no fígado na Unidade HPB do Hospital Geral de Leicester. O tamanho da amostra de 24 segmentos hepáticos foi determinado por cálculos de poder e está de acordo com o número de fígados realmente removidos por cirurgia hepática eletiva nos últimos anos. Nenhuma mudança no procedimento cirúrgico ou nos resultados de recrutamento deste estudo e no uso das amostras. Todo o trabalho experimental realizado nas amostras de fígado não terá nenhum efeito no paciente.

Experimentos incluem perfusão de segmento de órgão ex vivo e infecção com bactérias ou vírus. As biópsias dos 24 segmentos hepáticos perfundidos são processadas para corte de tecido in vitro e cultura de células macrófagas. As culturas de células primárias resultantes e as fatias de tecido serão armazenadas congeladas para pesquisas futuras. Todos os estudos in vitro dos 24 segmentos hepáticos e dos tecidos e células deles derivados avaliarão o efeito de intervenções terapêuticas (anticorpos, antagonistas de receptores, antibióticos e outras moléculas) na capacidade das células hepáticas de eliminar bactérias ou vírus invasores. Os experimentos serão realizados sempre que uma amostra de fígado estiver disponível.

A descrição técnica detalhada da estratégia experimental incluindo a estratégia de armazenamento e descarte do tecido humano será a seguinte:

1. Perfusão ex vivo do segmento hepático: Este trabalho é feito para estabilizar o órgão, infectar o órgão e, em seguida, derivar dele fatias de tecido e células para cultura celular primária. Configuramos com sucesso um modelo de perfusão de fígado suíno ex vivo normotérmico. Essa experiência nos permitiu definir os parâmetros para coleta de órgãos, transporte e perfusão de fígados suínos por até vinte e quatro horas e desenvolver um modelo de infecção importante. A infecção mostrou conservação da capacidade de remover bactérias do sangue e boa capacidade de filtragem e, essencial para esta aplicação, que também em todo o modelo de órgão subconjuntos específicos de macrófagos são permissivos à replicação intracelular bacteriana. Nesta série experimental propomos a perfusão de segmentos hepáticos humanos explantados. Ao contrário dos suínos, usaremos para perfusão o meio sintético de órgão humano a fim de neutralizar ou minimizar a imunidade adquirida. Histologia, microscopia confocal, análise FACS e enumeração bacteriana e viral serão as principais metodologias para analisar o órgão perfundido. O objetivo desta parte do trabalho é demonstrar que, no nível do órgão, bactérias e vírus são capazes de se replicar em macrófagos do tecido hepático, chamando a atenção dos tratamentos anti-infecciosos para a prevenção dessas etapas iniciais, potencialmente prevenindo doenças bacterianas e virais invasivas. As amostras dos 24 segmentos de órgãos perfundidos serão a fonte de culturas de fatias de tecido e culturas de células primárias.
2. Culturas de células primárias: Dos 24 segmentos de fígado humano, derivaremos amostras para cultura primária de macrófagos de tecidos humanos e outras células imunes. Utilizando a metodologia em uso para células de camundongos e suínos, faremos culturas primárias de células imunes hepáticas humanas e em particular macrófagos. Células imunes, incluindo macrófagos e neutrófilos, serão purificadas por diferentes metodologias, incluindo centrifugação em gradiente de percoll, FACS e separação magnética e cultivadas por até sete dias. As culturas serão testadas para múltiplos parâmetros, incluindo citocinas, marcadores de superfície, produção de qualquer pessoa e expressão gênica. Para testar a interação com bactérias ou vírus, as células cultivadas serão infectadas com um painel de patógenos bacterianos e virais. Em outra metodologia, microscopia confocal, FACS e RNAseq serão usados ​​para monitorar o comportamento de patógenos bacterianos e virais e células hospedeiras. Intervenções com citocinas, quimiocinas, drogas, antibióticos e outros compostos serão realizadas para testar a rastreabilidade do sistema. Não será realizada genotipagem do órgão. Com o objetivo de identificar alvos para intervenção, os modelos de cultura celular pretendem fornecer parâmetros quantificáveis ​​detalhados da interação de bactérias ou vírus e células imunes em particular macrófagos teciduais em um sistema de cultura in vitro controlado. Isto destina-se a permitir a concepção de ensaios de rendimento médio para testar estratégias que modificam o início da doença invasiva. As células serão armazenadas em nitrogênio líquido para futuras pesquisas.
3. Culturas de fatias organotípicas: Dos 24 segmentos de fígado humano derivaremos, além das células, também amostras de tecido para culturas de fatias organotípicas. Com a metodologia bem estabelecida para fatias de cérebro e descrita para fígado, vamos cultivar culturas organotípicas de fatias de fígado humano. Essas fatias de órgãos são superiores às culturas de células, pois mantêm a microarquitetura espacial multicelular do órgão, o que é particularmente importante ao analisar macrófagos teciduais. Quanto às culturas de fatias de cérebro, vamos infectar as fatias com patógenos bacterianos ou virais e monitorar sua migração dentro do tecido, a infecção de células e a reação das células hospedeiras individuais. O uso de cultura de fatia de tecido deve permitir estudar especificamente o direcionamento e a natureza permissiva de replicação de subconjuntos específicos de células imunes, incluindo macrófagos. Uma meta do objetivo é permitir o desenvolvimento detalhado de focos infecciosos no fígado, incluindo microscopia confocal de lapsos de tempo de fatias de fígado infectadas. Espera-se que o teste neste modelo de citocinas e outras moléculas derivadas do hospedeiro mostre o potencial de intervenções direcionadas a subconjuntos específicos de células imunes, incluindo macrófagos. Fatias de tecido serão armazenadas em nitrogênio líquido para pesquisas futuras.