Modelos de tejido para enfermedades hepáticas (TIMOLD)

Este es un proyecto de investigación preclínica y no está prevista ninguna intervención del paciente. El proyecto utiliza muestras anonimizadas de tejido humano desechadas durante una cirugía radical. Las muestras de segmento de hígado incluidas en este proyecto serán de pacientes sometidos a cirugía electiva por una lesión en el hígado en la Unidad HPB del Hospital General de Leicester. El tamaño de la muestra de 24 segmentos hepáticos se ha determinado mediante cálculos de potencia y está en consonancia con el número de hígados realmente extirpados mediante cirugía hepática electiva en los últimos años. Ningún cambio en el procedimiento quirúrgico o los resultados de reclutamiento de este estudio y el uso de las muestras. Todo el trabajo experimental realizado en las muestras de hígado no tendrá ningún efecto sobre el paciente.

Los experimentos incluyen perfusión de segmentos de órganos ex vivo e infección con bacterias o virus. Las biopsias de los 24 segmentos hepáticos perfundidos se procesan para el corte de tejido in vitro y el cultivo de células de macrófagos. Los cultivos de células primarias resultantes y los cortes de tejido se almacenarán congelados para futuras investigaciones. Todos los estudios in vitro sobre los 24 segmentos hepáticos y los tejidos y células derivados de ellos evaluarán el efecto de las intervenciones terapéuticas (anticuerpos, antagonistas de receptores, antibióticos y otras moléculas) sobre la capacidad de las células hepáticas para eliminar bacterias o virus invasivos. Los experimentos se realizarán cada vez que se disponga de una muestra de hígado.

La descripción técnica detallada de la estrategia experimental, incluida la estrategia de almacenamiento y descarte del tejido humano, será la siguiente:

1. Perfusión ex vivo del segmento hepático: este trabajo se realiza para estabilizar el órgano, infectarlo y luego derivar de él cortes de tejido y células para el cultivo celular primario. Hemos establecido con éxito un modelo de perfusión de hígado porcino normotérmico ex vivo. Esta experiencia nos permitió definir los parámetros para la recolección de órganos, el transporte y la perfusión de hígados porcinos durante un máximo de veinticuatro horas y, lo que es más importante, desarrollar un modelo de infección. La infección mostró conservación de la capacidad para eliminar bacterias de la sangre y una buena capacidad de filtración y, esencial para esta aplicación, que también en el modelo de órgano completo, subconjuntos específicos de macrófagos son permisivos para la replicación intracelular bacteriana. En esta serie experimental, proponemos perfundir segmentos de hígado humano explantados. A diferencia de los cerdos, utilizaremos para la perfusión del órgano humano medio sintético con el fin de neutralizar o minimizar la inmunidad adquirida. Histología, microscopía confocal, análisis FACS y enumeración bacteriana y viral serán las principales metodologías para analizar el órgano perfundido. El objetivo de esta parte del trabajo es demostrar que, a nivel de órganos, las bacterias y los virus pueden replicarse en los macrófagos del tejido hepático, señalando la atención de los tratamientos antiinfecciosos para la prevención de estos primeros pasos, lo que podría prevenir enfermedades bacterianas y virales invasivas. Las muestras de los 24 segmentos de órganos perfundidos serán la fuente de cultivos de cortes de tejido y cultivos de células primarias.
2. Cultivos de células primarias: de los 24 segmentos de hígado humano obtendremos muestras para el cultivo primario de macrófagos de tejidos humanos y otras células inmunitarias. Usando la metodología en uso para células de ratones y cerdos, estableceremos cultivos primarios de células inmunes hepáticas humanas y, en particular, de macrófagos. Las células inmunitarias, incluidos los macrófagos y los neutrófilos, se purificarán mediante diferentes metodologías, incluida la centrifugación en gradiente de percoll, FACS y separación magnética, y se cultivarán durante un máximo de siete días. Los cultivos se analizarán para múltiples parámetros, incluidas las citoquinas, los marcadores de superficie, la producción de cualquiera y la expresión génica. Para probar la interacción con bacterias o virus, las células cultivadas se infectarán con un panel de patógenos bacterianos y virales. Sobre otra metodología, se utilizará microscopía confocal, FACS y RNAseq para monitorear el comportamiento de patógenos bacterianos y virales y células huésped. Se llevarán a cabo intervenciones con citocinas, quimiocinas, fármacos, antibióticos y otros compuestos para probar la manejabilidad del sistema. No se realizará genotipado del órgano. Con el objetivo de identificar objetivos para la intervención, los modelos de cultivo celular están destinados a proporcionar parámetros cuantificables detallados de la interacción de bacterias o virus y células inmunitarias, en particular macrófagos tisulares, en un sistema de cultivo in vitro controlado. Esto tiene como objetivo permitir el diseño de ensayos de rendimiento medio para probar estrategias que modifican el inicio de la enfermedad invasiva. Las células se almacenarán en nitrógeno líquido para futuras investigaciones.
3. Cultivos de cortes organotípicos: De los 24 segmentos de hígado humano obtendremos, además de células, también muestras de tejido para cultivos de cortes organotípicos. Con la metodología bien establecida para cortes de cerebro y descrita para hígado, cultivaremos cultivos organotípicos de cortes de hígado humano. Estos cortes de órganos son superiores a los cultivos celulares, ya que mantienen la microarquitectura espacial multicelular del órgano, lo que es especialmente importante cuando se analizan macrófagos tisulares. En cuanto a los cultivos de cortes de cerebro, infectaremos los cortes con patógenos bacterianos o virales y controlaremos su migración dentro del tejido, la infección de las células y la reacción de las células huésped individuales. El uso del cultivo de cortes de tejido debería permitir estudiar específicamente la orientación y la naturaleza permisiva de la replicación de subconjuntos específicos de células inmunitarias, incluidos los macrófagos. Un objetivo del objetivo es permitir el desarrollo detallado de focos infecciosos en el hígado, incluida la microscopía confocal de intervalos de tiempo de cortes de hígado infectado. Se espera que las pruebas en este modelo de citocinas y otras moléculas derivadas del huésped muestren el potencial de las intervenciones dirigidas a subconjuntos específicos de células inmunitarias, incluidos los macrófagos. Las rebanadas de tejido se almacenarán en nitrógeno líquido para futuras investigaciones.