Modele tkankowe dla chorób wątroby (TIMOLD)

Jest to przedkliniczny projekt badawczy i nie planuje się interwencji pacjenta. W projekcie wykorzystano anonimowe próbki tkanek ludzkich wyrzucone podczas radykalnej operacji. Próbki segmentów wątroby uwzględnione w tym projekcie będą pochodzić od pacjentów poddawanych planowej operacji zmiany w wątrobie na oddziale HPB Szpitala Ogólnego w Leicester. Wielkość próbki 24 segmentów wątroby została określona za pomocą obliczeń mocy i jest zgodna z liczbą wątrób faktycznie usuniętych podczas planowych operacji wątroby w ostatnich latach. Żadne zmiany w procedurze chirurgicznej lub rekrutacji nie wynikają z tego badania i wykorzystania próbek. Wszystkie prace eksperymentalne przeprowadzone na próbkach wątroby nie będą miały wpływu na pacjenta.

Eksperymenty obejmują perfuzję segmentu narządu ex vivo i infekcję bakteriami lub wirusami. Biopsje perfundowanych 24 segmentów wątroby są przetwarzane do skrawków tkanki in vitro i hodowli komórkowej makrofagów. Powstałe pierwotne hodowle komórkowe i skrawki tkanek będą przechowywane w stanie zamrożonym do przyszłych badań. Wszystkie badania in vitro na 24 segmentach wątroby oraz pochodzących z nich tkankach i komórkach będą oceniać wpływ interwencji terapeutycznych (przeciwciała, antagoniści receptorów, antybiotyki i inne molekuły) na zdolność komórek wątroby do usuwania inwazyjnych bakterii lub wirusów. Eksperymenty będą przeprowadzane za każdym razem, gdy dostępna będzie próbka wątroby.

Szczegółowy opis techniczny strategii eksperymentalnej, w tym strategii przechowywania i usuwania tkanki ludzkiej, będzie następujący:

1. Perfuzja segmentu wątroby ex vivo: Ta praca jest wykonywana w celu ustabilizowania narządu, zakażenia narządu, a następnie pobrania z niego skrawków tkanki i komórek do pierwotnej hodowli komórkowej. Udało nam się stworzyć normotermiczny model perfuzji wątroby świni ex vivo. Ta ekspertyza pozwoliła nam określić parametry pobierania narządów, transportu i perfuzji wątroby wieprzowej na okres do 24 godzin oraz, co ważne, opracować model infekcji. Infekcja wykazała zachowanie zdolności do usuwania bakterii z krwi i dobrą zdolność filtrowania oraz, co istotne dla tego zastosowania, że ​​również w modelu całego narządu określone podzbiory makrofagów pozwalają na replikację wewnątrzkomórkową bakterii. W tej serii eksperymentów proponujemy perfuzję eksplantowanych segmentów ludzkiej wątroby. W przeciwieństwie do świń, do perfuzji ludzkich narządów użyjemy syntetycznego podłoża w celu zneutralizowania lub zminimalizowania nabytej odporności. Histologia, mikroskopia konfokalna, analiza FACS oraz liczba bakterii i wirusów będą głównymi metodologiami analizy perfundowanego narządu. Celem tej części pracy jest wykazanie, że na poziomie narządowym bakterie i wirusy są zdolne do replikacji w makrofagach tkanki wątroby, zwracając uwagę w leczeniu przeciwinfekcyjnym na zapobieganie tym wczesnym etapom, potencjalnie zapobiegając inwazyjnej chorobie bakteryjnej i wirusowej. Próbki z 24 perfundowanych segmentów narządów będą źródłem hodowli skrawków tkankowych i pierwotnych hodowli komórkowych.
2. Pierwotne hodowle komórkowe: Z 24 segmentów ludzkiej wątroby pobierzemy próbki do pierwotnej hodowli ludzkich makrofagów tkankowych i innych komórek odpornościowych. Korzystając z metodologii stosowanej w przypadku komórek myszy i świń, stworzymy pierwotne hodowle ludzkich komórek odpornościowych wątroby, aw szczególności makrofagów. Komórki odpornościowe, w tym makrofagi i neutrofile, zostaną oczyszczone różnymi metodami, w tym przez wirowanie w gradiencie percoll, FACS i separację magnetyczną, i będą hodowane przez maksymalnie siedem dni. Hodowle będą testowane pod kątem wielu parametrów, w tym cytokin, markerów powierzchniowych, produkcji kogokolwiek i ekspresji genów. Aby przetestować interakcję z bakteriami lub wirusami, hodowane komórki zostaną zainfekowane panelem patogenów bakteryjnych i wirusowych. W oparciu o inną metodologię, mikroskopia konfokalna, FACS i RNAseq zostaną wykorzystane do monitorowania zachowania patogenów bakteryjnych i wirusowych oraz komórek gospodarza. Zostaną przeprowadzone interwencje z cytokinami, chemokinami, lekami, antybiotykami i innymi związkami, aby przetestować podatność systemu. Nie zostanie wykonane żadne genotypowanie narządu. Mając na uwadze identyfikację celów interwencji, modele hodowli komórkowych mają na celu dostarczenie szczegółowych, wymiernych parametrów interakcji bakterii lub wirusów i komórek odpornościowych, w szczególności makrofagów tkankowych, w kontrolowanym systemie hodowli in vitro. Ma to umożliwić zaprojektowanie testów o średniej przepustowości do testowania strategii modyfikujących inicjację choroby inwazyjnej. Komórki będą przechowywane w ciekłym azocie do dalszych badań.
3. Organotypowe hodowle skrawkowe: Z 24 segmentów ludzkiej wątroby pobierzemy, oprócz komórek, również próbki tkanek do hodowli organotypowych. Mając dobrze opracowaną metodologię dla skrawków mózgu i opisaną dla wątroby, będziemy hodować organotypowe hodowle skrawków ludzkiej wątroby. Te wycinki narządów są lepsze od kultur komórkowych, ponieważ utrzymują wielokomórkową przestrzenną mikroarchitekturę narządu, co jest szczególnie ważne przy analizie makrofagów tkankowych. Jeśli chodzi o hodowle wycinków mózgu, będziemy je infekować bakteryjnymi lub wirusowymi patogenami i monitorować ich migrację w tkance, infekcję komórek i reakcję pojedynczych komórek gospodarza. Zastosowanie hodowli wycinków tkankowych powinno pozwolić na szczegółowe zbadanie ukierunkowanego i permisywnego charakteru replikacji określonych podzbiorów komórek odpornościowych, w tym makrofagów. Celem celu jest umożliwienie szczegółowego rozwoju ognisk zakaźnych w wątrobie, w tym mikroskopii konfokalnej w odstępach czasowych zakażonych skrawków wątroby. Oczekuje się, że testowanie w tym modelu cytokin i innych cząsteczek pochodzących od gospodarza wykaże potencjał interwencji ukierunkowanych na określone podzbiory komórek odpornościowych, w tym makrofagi. Wycinki tkanek będą przechowywane w ciekłym azocie do dalszych badań.