Maksasairauksien kudosmallit (TIMOLD)

Tämä on prekliininen tutkimusprojekti, eikä potilaan interventiota ole suunniteltu. Hankkeessa hyödynnetään radikaalin leikkauksen aikana hylättyjä anonymisoituja ihmiskudosnäytteitä. Tähän projektiin sisältyvät maksasegmenttinäytteet ovat potilailta, joille tehdään elektiivinen leikkaus Leicester General Hospitalin HPB-yksikön maksavaurion vuoksi. 24 maksasegmentin otoskoko on määritetty teholaskelmilla ja se on linjassa elektiivisellä maksaleikkauksella viime vuosien aikana poistettujen maksan määrän kanssa. Tästä tutkimuksesta ja näytteiden käytöstä ei tehty muutoksia kirurgisessa toimenpiteessä tai rekrytointituloksissa. Kaikilla maksanäytteillä tehdyillä kokeellisilla töillä ei ole vaikutusta potilaaseen.

Kokeet sisältävät ex vivo -elimen segmentin perfuusion ja infektion bakteereilla tai viruksilla. Perfusoidun 24 maksasegmentin biopsiat käsitellään in vitro -kudosviipale- ja makrofagisoluviljelmää varten. Tuloksena saadut primaarisoluviljelmät ja kudosviipaleet varastoidaan pakastettuna tulevaa tutkimusta varten. Kaikissa in vitro -tutkimuksissa maksan 24 segmentillä ja niistä johdetuilla kudoksilla ja soluilla arvioidaan terapeuttisten interventioiden (vasta-aineet, reseptoriantagonistit, antibiootit ja muut molekyylit) vaikutusta maksasolujen kykyyn puhdistaa invasiivisia bakteereja tai viruksia. Kokeet suoritetaan aina, kun maksanäyte on saatavilla.

Yksityiskohtainen tekninen kuvaus kokeellisesta strategiasta, mukaan lukien strategia ihmiskudoksen varastointia ja hävittämistä varten, on seuraava:

1. Maksasegmentin ex vivo -perfuusio: Tämä työ tehdään elimen stabiloimiseksi, elimen infektoimiseksi ja sen jälkeen kudosviipaleiden ja solujen saamiseksi primääristä soluviljelyä varten. Olemme onnistuneesti perustaneet normotermisen ex vivo sian maksan perfuusiomallin. Tämän asiantuntemuksen avulla pystyimme määrittelemään sian maksan elinten keruun, kuljetuksen ja perfuusion parametrit jopa 24 tunnin ajaksi ja mikä tärkeintä, kehitimme ja infektiomallin. Infektio osoitti bakteeripoistokapasiteetin säilymistä verestä ja hyvän suodatuskapasiteetin ja, mikä on olennaista tälle sovellukselle, että myös koko elinmallissa tietyt makrofagien alajoukot ovat sallivia bakteerien solunsisäiselle replikaatiolle. Tässä koesarjassa ehdotamme eksplantoitujen ihmisen maksasegmenttien perfusointia. Toisin kuin sioilla, käytämme ihmisen elimen synteettistä väliainetta perfuusioon neutraloimaan tai minimoimaan hankittu immuniteetti. Histologia, konfokaalinen mikroskopia, FACS-analyysi sekä bakteerien ja virusten luettelointi ovat tärkeimmät menetelmät perfusoidun elimen analysoinnissa. Tämän työn osan tavoitteena on osoittaa, että elinten tasolla bakteerit ja virukset pystyvät replikoitumaan maksakudoksen makrofageissa, kiinnittäen huomiota infektioiden vastaisiin hoitoihin näiden varhaisten vaiheiden ehkäisyyn, jotka mahdollisesti estävät invasiivisia bakteeri- ja virussairauksia. Näytteet 24 perfusoidusta elinsegmentistä ovat kudosviipaviljelmien ja primäärisoluviljelmien lähde.
2. Primäärisoluviljelmät: Otamme 24 ihmisen maksan segmentistä näytteitä ihmisen kudosmakrofagien ja muiden immuunisolujen primaariviljelmää varten. Hiiristä ja sioista peräisin oleville soluille käytössä olevaa metodologiaa käyttäen perustamme ihmisen maksan immuunisolujen ja erityisesti makrofagien primääriviljelmiä. Immuunisolut, mukaan lukien makrofagit ja neutrofiilit, puhdistetaan erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien percoll-gradienttisentrifugointi, FACS ja magneettierotus, ja niitä viljellään jopa seitsemän päivää. Viljelmistä testataan useita parametreja, mukaan lukien sytokiinit, pintamarkkerit, kenen tahansa tuotanto ja geeniekspressio. Vuorovaikutuksen testaamiseksi bakteerien tai virusten kanssa viljellyt solut infektoidaan joukolla bakteeri- ja viruspatogeenejä. Muilla menetelmillä bakteeri- ja viruspatogeenien ja isäntäsolujen käyttäytymisen seurantaan käytetään konfokaalimikroskopiaa, FACS:ää ja RNAseq:ia. Sytokiinien, kemokiinien, lääkkeiden, antibioottien ja muiden yhdisteiden interventioita suoritetaan järjestelmän ohjattavuuden testaamiseksi. Elimen genotyyppiä ei tehdä. Tarkoituksena on tunnistaa interventiokohteet, soluviljelymallit on tarkoitettu tarjoamaan yksityiskohtaisia ​​kvantitatiivisia parametreja bakteerien tai virusten ja immuunisolujen, erityisesti kudosmakrofagien, vuorovaikutuksesta kontrolloidussa in vitro -viljelyjärjestelmässä. Tämän tarkoituksena on mahdollistaa keskitehoisten määritysten suunnittelu strategioiden testaamiseksi, jotka muuttavat invasiivisen taudin alkamista. Solut varastoidaan nestetypessä jatkotutkimusta varten.
3. Organotyyppiset viipaleviljelmät: 24 ihmisen maksan segmentistä johdetaan solujen lisäksi myös kudosnäytteitä organotyyppisiin viipaleviljelmiin. Aivoviipaleille hyvin laaditulla ja maksalle kuvatulla menetelmällä viljelemme organotyyppisiä ihmisen maksaviipaleviljelmiä. Nämä elinviipaleet ovat parempia kuin soluviljelmät, koska ne ylläpitävät elimen monisoluista spatiaalista mikroarkkitehtuuria, mikä on erityisen tärkeää kudosmakrofageja analysoitaessa. Mitä tulee aivoviipaleviljelmiin, infektoimme viipaleita bakteeri- tai viruspatogeeneillä ja seuraamme niiden kulkeutumista kudoksessa, solujen tartuntaa ja yksittäisten isäntäsolujen reaktiota. Kudosviipaviljelmän käytön pitäisi mahdollistaa immuunisolujen spesifisten alaryhmien, mukaan lukien makrofagit, kohdistuksen ja replikaation sallivan luonteen spesifinen tutkiminen. Tavoitteena on mahdollistaa infektoivien pesäkkeiden yksityiskohtainen kehittyminen maksassa, mukaan lukien infektoituneiden maksaviipaleiden konfokaalimikroskopia. Tämän mallin sytokiinien ja muiden isäntäperäisten molekyylien testaamisen odotetaan osoittavan interventioiden potentiaalin, jotka kohdistuvat immuunisolujen tiettyihin alaryhmiin, mukaan lukien makrofagit. Kudosviipaleet säilytetään nestetypessä jatkotutkimusta varten.