Modèles tissulaires pour les maladies du foie (TIMOLD)

Il s'agit d'un projet de recherche préclinique et aucune intervention du patient n'est prévue. Le projet utilise des échantillons de tissus humains anonymisés rejetés lors d'une chirurgie radicale. Les échantillons de segments de foie inclus dans ce projet proviendront de patients subissant une chirurgie élective pour une lésion du foie dans l'unité HPB de l'hôpital général de Leicester. La taille de l'échantillon de 24 segments de foie a été déterminée par des calculs de puissance et correspond au nombre de foies effectivement retirés par chirurgie hépatique élective au cours des dernières années. Aucun changement dans la procédure chirurgicale ou les résultats de recrutement de cette étude et de l'utilisation des échantillons. Tous les travaux expérimentaux effectués sur les échantillons de foie n'auront aucun effet sur le patient.

Les expériences comprennent la perfusion de segments d'organes ex vivo et l'infection par des bactéries ou des virus. Des biopsies des 24 segments de foie perfusés sont traitées pour une coupe de tissu in vitro et une culture de cellules macrophages. Les cultures de cellules primaires et les tranches de tissus qui en résultent seront conservées congelées pour de futures recherches. Toutes les études in vitro sur les 24 segments du foie, et les tissus et cellules qui en sont dérivés, évalueront l'effet des interventions thérapeutiques (anticorps, antagonistes des récepteurs, antibiotiques et autres molécules) sur la capacité des cellules hépatiques à éliminer les bactéries ou virus invasifs. Les expériences seront réalisées chaque fois qu'un échantillon de foie sera disponible.

La description technique détaillée de la stratégie expérimentale, y compris la stratégie de stockage et d'élimination des tissus humains, sera la suivante :

1. Perfusion ex vivo de segment de foie : Ce travail est effectué pour stabiliser l'organe, infecter l'organe et ensuite en tirer des tranches de tissu et des cellules pour la culture cellulaire primaire. Nous avons mis en place avec succès un modèle normo-thermique ex vivo de perfusion hépatique porcine. Cette expertise nous a permis de définir les paramètres de prélèvement d'organes, de transport et de perfusion de foies porcins jusqu'à vingt-quatre heures et surtout de développer un modèle d'infection. L'infection a montré la conservation de la capacité à éliminer les bactéries du sang et une bonne capacité de filtrage et, ce qui est essentiel pour cette application, également dans l'ensemble du modèle d'organe, des sous-ensembles spécifiques de macrophages sont permissifs à la réplication intracellulaire bactérienne. Dans cette série expérimentale, nous proposons de perfuser des segments de foie humain explantés. Contrairement aux porcs, on utilisera pour la perfusion de l'organe humain un milieu synthétique afin de neutraliser ou minimiser l'immunité acquise. L'histologie, la microscopie confocale, l'analyse FACS et la numération bactérienne et virale seront les principales méthodologies d'analyse de l'organe perfusé. L'objectif de cette partie du travail est de démontrer qu'au niveau des organes, les bactéries et les virus sont capables de se répliquer dans les macrophages des tissus hépatiques, soulignant l'attention des traitements anti-infectieux sur la prévention de ces premières étapes potentiellement préventives des maladies bactériennes et virales invasives. Les échantillons des 24 segments d'organes perfusés seront la source de cultures de tranches de tissus et de cultures de cellules primaires.
2. Cultures de cellules primaires : À partir des 24 segments de foie humain, nous dériverons des échantillons pour la culture primaire de macrophages de tissus humains et d'autres cellules immunitaires. En utilisant la méthodologie en usage pour les cellules de souris et de porc, nous mettrons en place des cultures primaires de cellules immunitaires hépatiques humaines et en particulier de macrophages. Les cellules immunitaires, y compris les macrophages et les neutrophiles, seront purifiées par différentes méthodologies, notamment par centrifugation en gradient de percoll, FACS et séparation magnétique, et cultivées jusqu'à sept jours. Les cultures seront testées pour de multiples paramètres, y compris les cytokines, les marqueurs de surface, la production de n'importe qui et l'expression des gènes. Pour tester l'interaction avec des bactéries ou des virus, les cellules cultivées seront infectées par un panel de pathogènes bactériens et viraux. Sur une autre méthodologie, la microscopie confocale, le FACS et le RNAseq seront utilisés pour surveiller le comportement des pathogènes bactériens et viraux et des cellules hôtes. Des interventions avec des cytokines, des chimiokines, des médicaments, des antibiotiques et d'autres composés seront effectuées pour tester la traçabilité du système. Aucun génotypage de l'organe ne sera effectué. Dans le but d'identifier des cibles d'intervention, les modèles de culture cellulaire sont destinés à fournir des paramètres quantifiables détaillés de l'interaction des bactéries ou virus et des cellules immunitaires en particulier des macrophages tissulaires dans un système de culture in vitro contrôlé. Ceci est destiné à permettre la conception d'essais à moyen débit pour tester des stratégies modifiant l'initiation d'une maladie invasive. Les cellules seront stockées dans de l'azote liquide pour des recherches ultérieures.
3. Cultures de tranches organotypiques : À partir des 24 segments de foie humain, nous dériverons, en plus des cellules, également des échantillons de tissus pour les cultures de tranches organotypiques. Avec la méthodologie bien établie pour les tranches de cerveau et décrite pour le foie, nous cultiverons des cultures organotypiques de tranches de foie humain. Ces tranches d'organes sont supérieures aux cultures cellulaires, car elles maintiennent la microarchitecture spatiale multicellulaire de l'organe, ce qui est particulièrement important lors de l'analyse des macrophages tissulaires. En ce qui concerne les cultures de tranches de cerveau, nous infecterons les tranches avec des agents pathogènes bactériens ou viraux et surveillerons leur migration dans le tissu, l'infection des cellules et la réaction des cellules hôtes individuelles. L'utilisation de la culture de tranches de tissus devrait permettre d'étudier spécifiquement le ciblage et la nature permissive à la réplication de sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, y compris les macrophages. Un but de l'objectif est de permettre le développement détaillé des foyers infectieux dans le foie, y compris la microscopie confocale de tours de temps des tranches de foie infectées. Les tests dans ce modèle de cytokines et d'autres molécules dérivées de l'hôte devraient montrer le potentiel d'interventions ciblant des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, y compris les macrophages. Les tranches de tissus seront stockées dans de l'azote liquide pour des recherches ultérieures.