Тканевые модели для заболеваний печени (TIMOLD)

Это доклинический исследовательский проект, и вмешательство пациента не планируется. В проекте используются анонимные образцы тканей человека, выброшенные во время радикальной операции. Образцы сегментов печени, включенные в этот проект, будут получены от пациентов, перенесших плановую операцию по поводу поражения печени в отделении HPB Лестерской больницы общего профиля. Размер выборки из 24 сегментов печени был определен с помощью расчетов мощности и соответствует количеству печени, фактически удаленной в результате плановой операции на печени за последние годы. Никаких изменений в хирургической процедуре или наборе результатов в результате этого исследования и использования образцов. Вся экспериментальная работа, проводимая с образцами печени, не окажет никакого влияния на пациента.

Эксперименты включают перфузию сегментов органов ex vivo и заражение бактериями или вирусами. Биопсии перфузированных 24 сегментов печени обрабатывают для получения срезов ткани in vitro и культуры клеток макрофагов. Полученные первичные клеточные культуры и срезы тканей будут храниться в замороженном виде для будущих исследований. Все исследования in vitro на 24 сегментах печени, тканях и клетках, полученных из них, будут оценивать влияние терапевтических вмешательств (антитела, антагонисты рецепторов, антибиотики и другие молекулы) на способность клеток печени уничтожать инвазивные бактерии или вирусы. Эксперименты будут проводиться каждый раз, когда будет доступен образец печени.

Подробное техническое описание экспериментальной стратегии, включая стратегию хранения и утилизации тканей человека, будет следующим:

1. Перфузия сегмента печени ex vivo: эта работа проводится для стабилизации органа, инфицирования органа, а затем для получения из него срезов ткани и клеток для первичной клеточной культуры. Мы успешно создали нормотермическую модель перфузии свиной печени ex vivo. Этот опыт позволил нам определить параметры сбора органов, транспортировки и перфузии свиной печени на срок до двадцати четырех часов и, что важно, разработать модель заражения. Инфекция показала сохранение способности удалять бактерии из крови и хорошую фильтрующую способность, а также, что важно для этого применения, то, что в модели целого органа специфические подмножества макрофагов допускают внутриклеточную репликацию бактерий. В этой экспериментальной серии мы предлагаем перфузии эксплантированных сегментов печени человека. В отличие от свиней мы будем использовать для перфузии органов человека синтетическую среду с целью нейтрализации или минимизации приобретенного иммунитета. Гистология, конфокальная микроскопия, анализ FACS и подсчет бактерий и вирусов будут основными методологиями анализа перфузируемого органа. Цель этой части работы — продемонстрировать, что на уровне органов бактерии и вирусы способны размножаться в макрофагах ткани печени, акцентируя внимание противоинфекционных методов лечения на предотвращении этих ранних шагов, потенциально предотвращающих инвазивные бактериальные и вирусные заболевания. Образцы из 24 перфузируемых сегментов органов будут источником культур срезов тканей и первичных клеточных культур.
2. Первичные клеточные культуры: из 24 сегментов печени человека мы получим образцы для первичной культуры макрофагов тканей человека и других иммунных клеток. Используя методологию, используемую для клеток мышей и свиней, мы создадим первичные культуры иммунных клеток печени человека и, в частности, макрофагов. Иммунные клетки, включая макрофаги и нейтрофилы, будут очищаться с помощью различных методик, включая центрифугирование в градиенте перколла, FACS и магнитную сепарацию, и культивироваться в течение семи дней. Культуры будут протестированы по нескольким параметрам, включая цитокины, поверхностные маркеры, продукцию кого-либо и экспрессию генов. Чтобы проверить взаимодействие с бактериями или вирусами, культивируемые клетки будут инфицированы набором бактериальных и вирусных патогенов. Согласно другой методологии, конфокальная микроскопия, FACS и RNAseq будут использоваться для мониторинга поведения бактериальных и вирусных патогенов и клеток-хозяев. Вмешательства с цитокинами, хемокинами, лекарствами, антибиотиками и другими соединениями будут проводиться для проверки управляемости системы. Генотипирование органа не проводится. С целью определения мишеней для вмешательства модели клеточных культур предназначены для предоставления поддающихся количественной оценке параметров взаимодействия бактерий или вирусов и иммунных клеток, в частности тканевых макрофагов, в контролируемой системе культивирования in vitro. Это предназначено для того, чтобы позволить разработать анализы со средней пропускной способностью для проверки стратегий, изменяющих инициирование инвазивного заболевания. Клетки будут храниться в жидком азоте для дальнейших исследований.
3. Органотипические культуры срезов: Из 24 сегментов печени человека мы получим, помимо клеток, также образцы тканей для органотипических культур срезов. С методологией, хорошо настроенной для срезов мозга и описанной для печени, мы будем культивировать органотипические культуры срезов печени человека. Эти срезы органов превосходят клеточные культуры, так как они сохраняют многоклеточную пространственную микроархитектуру органа, что особенно важно при анализе тканевых макрофагов. Что касается культур срезов мозга, мы будем заражать срезы бактериальными или вирусными патогенами и отслеживать их миграцию в ткани, заражение клеток и реакцию отдельных клеток-хозяев. Использование культуры срезов тканей должно позволить специально изучить нацеливание и разрешающую репликацию природу определенных подмножеств иммунных клеток, включая макрофаги. Целью задачи является обеспечение детального развития инфекционных очагов в печени, включая конфокальную микроскопию с интервалами времени инфицированных срезов печени. Ожидается, что тестирование в этой модели цитокинов и других молекул, происходящих от хозяина, продемонстрирует потенциал вмешательств, нацеленных на определенные подмножества иммунных клеток, включая макрофаги. Срезы тканей будут храниться в жидком азоте для дальнейших исследований.