回腸タンパク質消化率を測定するための二重同位体法の検証 (VALDIM)

試験食は、30 gの2H卵タンパク質と800 mgの[U-13C]スピルリナまたは400 mgの13C遊離AA混合物を含む60 gの凍結乾燥全卵粉末からなり、水と混合してオムレツとして調理します。 2H 卵パウダーは、バンガロール (インド) にあるセント ジョンズ研究所の協力者によって製造されました。 セライト（酸不溶性灰、Advanced Minerals Corporation）を、廃液中の食事の回収をチェックするための難消化性マーカーとして食事に添加する。 試験食は、被験者のグループに応じて、ボーラスまたはプラトー給餌（繰り返しのミニ食）として与えられます。 600 g の 2H 標識凍結乾燥卵は、毎日の飼料とともに均一に 2H 標識された AA 混合物を 60 日間経口投与された採卵鶏から得られます。 人間が消費する際の安全性を確保するために、微生物学的分析が行われます。

研究終了時には18人のボランティアが参加し、アヴィセンヌ病院（フランス）の人間栄養研究センターで検査を受けることになる。 主な参加基準は、18 ～ 45 歳、体格指数 (BMI) 18 ～ 30 kg/m2 の男性と女性です。 主な除外基準は、消化器または肝臓の病状、卵に対するアレルギー、ラテックスに対するアレルギー、妊婦です。 挿管という侵襲的な手順のため、研究者らは通常の40％の脱落者に対応するために30人のボランティアを募集する予定だ。

被験者は n = 6 の 3 つのグループに分けられます。

• ボーラス-spi、n = 6、ボランティアは、13C-スピルリナを参照タンパク質として使用し、t = 0で一度にボーラスとして試験食を摂取します。
• プラトー-spi、n = 6、ボランティアは、参照タンパク質として 13C-スピルリナを使用して、プラトー給餌プロトコルでテスト食事を摂取します。
• プラトーAA、n = 6、ボランティアは、13Cを含まないAA混合物を参照「タンパク質」として、プラトー給餌プロトコルでテスト食事を摂取します。

実験の 1 週間前に、ボランティアはタンパク質摂取量を制御するために体重に合わせた標準的な食事に従います (体重 1 kg あたりタンパク質 1.3 g)。

ボランティアは実験前日の朝にアヴィセンヌ病院の人間栄養研究センターに到着します。 彼らには、腸管を24時間通過できるトリプルルーメン腸管が装備されます。 内腔の 1 つは放射線不透過性であり、腸内の非吸収性マーカーを灌流するのに役立ちます (スローマーカー法)。 2 番目のルーメンは、チューブの移動を容易にする重り付きバルーンを膨張させるために使用されます。 3 番目のルーメンは、灌流部位の 15 cm 下の流出液の連続吸引専用です。 廃液中の非吸収性マーカーの測定により、廃液の流量を決定することができます。

実験当日、回腸末端におけるチューブの位置を確認するために、X線撮影によってチューブの位置がチェックされます。 採血のために前腕の静脈にカテーテルが挿入されます。 非吸収性マーカーであるポリエチレングリコール (PEG) 4000 (20 g/l) の灌流は、1 ml/分の流速で開始されます。 腸の流れと回腸基底サンプルを 30 分間収集します。 基礎血漿と尿サンプルが収集されます。

t = 0 では、グループ「Bolus-spi」のボランティアは 20 分以内にすべてのテスト食事を消費します。 グループ「Plateau-spi」および「Plateau-AA」のボランティアの場合、試験食は 22 等分に分割され、最初の食事を 6 つのミニポーションの初回摂取量として消費します。 その後、7.5 時間にわたって 30 分ごとに 1 回分のミニポーションを摂取します。 一部は食事分析に当てられます。 t = 8 まで、腸内容物は吸引によって継続的に収集され、30 分ごとにプールされます。 血液は、4 時間の間は 1 時間ごとに、t = 5 から t = 8 までは 30 分ごとにサンプリングされます。 尿は、t=8 まで 2 時間ごとに収集されます (比例プールの各時点で尿排出量の総量が記録されます)。 呼気サンプルは 30 分ごとに収集されます。 二酸化炭素排出量 (VCO2) は、間接熱量測定 (Canopy) によって 10 分間、1 時間ごとに評価されます。 尿サンプルは、実験の開始時および研究プロトコル中に収集されます。 糞便サンプルは実験開始前と次の 24 時間以内に収集されます。 経鼻回腸チューブは、t = 8 での最後の排液収集後に除去されます。経鼻回腸チューブは、t = 8 での最後の排液収集後に除去されます。

次の分析が実行されます。

• 濁度法による消化物サンプル中の PEG-4000 の濃度
• 熱分解分析装置と組み合わせた同位体比質量分析法 (IRMS) による、食事および消化物サンプル中の総水素含有量と 2H 濃縮度
• IRMS と組み合わせた元素分析装置 (EA) による食事および消化物サンプル中の総炭素含有量と 13C 濃縮
• 超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) による食事および消化物サンプル中の AA 濃度
• 液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析 (LC-MS/MS) を組み合わせた、13C-AA および 2H-AA の血漿および食事サンプルの濃縮
• ガスクロマトグラフィー燃焼同位体比質量分析法 (GC-C-IRMS) による消化物および食事サンプル中の 13C-AA および 2H-AA の濃縮
• プールされた (0 ～ 8 時間) 消化物サンプル中のセライト含有量
• Multiflow-IRMS による呼気サンプル中の 13CO2
• 消化物、血漿、尿、糞便サンプルのアミノ酸ドームとペプチドドーム

分析の一部（LC-MS/MSによる13C-AAおよび2H-AA濃縮血漿および食事、オミクス分析）は、バンガロール（インド）のセントジョンズ研究所の協力者によって行われます。