Validace duální izotopové metody pro měření stravitelnosti ileálního proteinu (VALDIM)

Testovací jídlo se bude skládat z 60 g lyofilizovaného prášku z celých vajec, který obsahuje 30 g 2H-vaječné bílkoviny a 800 mg [U-13C]-spiruliny nebo 400 mg směsi AA bez 13C, smíchané s vodou a uvařené jako omeleta. Prášek z 2H vajec vyrobili naši spolupracovníci z Výzkumného ústavu svatého Jana v Bangalore (Indie). Celite (popel nerozpustný v kyselině, Advanced Minerals Corporation) bude přidán do šrotu jako nestravitelný marker pro kontrolu výtěžnosti šrotu v odpadních vodách. Testovací jídlo bude podáváno jako bolus nebo ve formě plateau (opakovaná minijídla) v závislosti na skupinách subjektů. 600 g lyofilizovaných vajec značených 2H se získá od nosnic, kterým se orálně po dobu 60 dnů s denním krmivem podává jednotná směs AA značená 2H. Pro zajištění jejich bezpečnosti pro lidskou spotřebu budou provedeny mikrobiologické analýzy.

Na konci studie bude zahrnuto 18 dobrovolníků, kteří budou testováni ve Výzkumném centru lidské výživy v nemocnici Avicenne (Francie). Hlavními kritérii pro zařazení jsou muži a ženy ve věku 18 až 45 let, index tělesné hmotnosti (BMI) 18 až 30 kg/m2. Hlavními vylučovacími kritérii jsou jakákoliv trávicí nebo jaterní patologie, alergie na vejce, alergie na latex, těhotné ženy. Vzhledem k invazivní proceduře intubace plánují vyšetřovatelé naverbovat 30 dobrovolníků, aby vyhověli obvyklým 40% výpadkům.

Předměty budou rozděleny do 3 skupin po n = 6:

• Bolus-spi, n = 6, dobrovolníci zkonzumují testované jídlo jako bolus najednou v t = 0, s 13C-spirulinou jako referenčním proteinem
• Plateau-spi, n = 6, dobrovolníci budou konzumovat testované jídlo v protokolu plateau krmení, s 13C-spirulinou jako referenčním proteinem
• Plateau-AA, n = 6, dobrovolníci zkonzumují testované jídlo v protokolu plateau krmení, se směsí AA bez 13C jako referenční „protein“

Týden před experimentem budou dobrovolníci dodržovat standardní dietu přizpůsobenou jejich tělesné hmotnosti, aby kontrolovali příjem bílkovin (1,3 g bílkovin/kg tělesné hmotnosti).

Dobrovolníci dorazí do Centra pro výzkum lidské výživy v nemocnici Avicenne ráno před dnem experimentu. Budou vybaveny střevní trubicí s trojitým lumenem, která bude ponechána procházet střevním traktem po dobu 24 hodin. Jeden z lumen je rentgenově neprůhledný a slouží k perfuzi nevstřebatelného maker ve střevě (metoda pomalého markeru). Druhý lumen je určen k nafouknutí zatíženého balónku, který usnadňuje migraci trubice. Třetí lumen je věnován kontinuální aspiraci efluentů, 15 cm pod perfuzním místem. Měření neabsorbovatelného markeru v odpadních vodách umožňuje stanovení průtoku odpadních vod.

V den experimentu bude poloha trubice zkontrolována rentgenově, aby se ověřilo její umístění na terminálním ileu. Do žíly na předloktí bude zaveden katétr pro odběr krve. Perfuze nevstřebatelného markeru, polyethylenglykolu (PEG) 4000 (20 g/l), začne při průtoku 1 ml/min. Střevní průtok a bazální ileální vzorek budou odebírány během 30 minut. Bude odebrán vzorek bazální plazmy a moči.

Při t = 0 zkonzumují dobrovolníci ze skupiny "Bolus-spi" veškeré testovací jídlo za méně než 20 minut. Pro dobrovolníky ze skupin „Plateau-spi“ a „Plateau-AA“ bude testovací jídlo rozděleno na 22 stejných porcí a první jídlo zkonzumují jako úvodní dávku 6 miniporcí. Poté budou konzumovat jednotlivé miniporce každých 30 minut po dobu 7,5 hodiny. Jedna porce bude věnována rozborům jídel. Až do t = 8 bude střevní obsah nepřetržitě shromažďován aspirací a shromažďován každých 30 minut. Krev bude odebírána každou hodinu po dobu 4 hodin a každých 30 minut od t = 5 do t = 8. Moč bude odebírána každé 2 hodiny až do t=8 (celkový objem vytékané moči bude zaznamenán v každém časovém bodě pro proporcionální shromažďování). Vzorky dechu budou odebírány každých 30 minut. Výdej oxidu uhličitého (VCO2) bude vyhodnocován každou hodinu během 10 minut nepřímou kalorimetrií (Canopy). Vzorek moči bude odebrán na začátku experimentu a během protokolu studie. Vzorky stolice budou odebrány před začátkem experimentu a během následujících 24 hodin. Naso-ileální trubice bude odstraněna po posledním odběru výtoku v t = 8. Nazo-ileální trubice bude odstraněna po posledním odběru výtoku v t=8.

Budou provedeny následující analýzy:

• Koncentrace PEG-4000 turbidimetrickou metodou ve vzorcích digestátu
• Celkový obsah vodíku a 2H obohacení ve vzorcích jídla a tráveniny pomocí izotopové poměrové hmotnostní spektrometrie (IRMS) spojené s pyrolýzním analyzátorem
• Celkový obsah uhlíku a obohacení 13C ve vzorcích jídel a tráveniny pomocí Elemental analyzátoru (EA) spojeného s IRMS
• Koncentrace AA v pokrmech a vzorcích tráveniny pomocí ultra vysokovýkonné kapalinové chromatografie (UHPLC)
• Vzorky plazmy a moučky obohacené 13C-AA a 2H-AA pomocí kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS)
• Obohacení 13C-AA a 2H-AA ve vzorcích tráveniny a moučky pomocí plynové chromatografie-spalovací-izotopová poměrová hmotnostní spektrometrie (GC-C-IRMS)
• Obsah celitu ve sdružených (0-8 h) vzorcích tráveniny
• 13CO2 ve vzorku dechu pomocí Multiflow-IRMS
• Aminoacidom a peptidom vzorků tráveniny, plazmy, moči a stolice

Část analýz (plazma a moučka obohacená 13C-AA a 2H-AA pomocí LC-MS/MS, -omické analýzy) budou provedeny našimi spolupracovníky z Výzkumného ústavu svatého Jana v Bangalore (Indie).