Convalida del metodo a doppio isotopo per misurare la digeribilità delle proteine ​​ileali (VALDIM)

Il pasto di prova consisterà in 60 g di polvere di uovo intero liofilizzato che contiene 30 g di proteine ​​dell'uovo 2H e 800 mg di [U-13C]-spirulina o 400 mg di miscela di AA libero 13C, mescolata con acqua e cotta come una frittata. La polvere 2H-egg è stata prodotta dai nostri collaboratori del St John's Research Institute di Bangalore (India). La celite (cenere insolubile in acido, Advanced Minerals Corporation) verrà aggiunta alla farina come marcatore non digeribile per verificare il recupero della farina negli effluenti. Il pasto di prova verrà somministrato come bolo o in un'alimentazione plateau (mini-pasti ripetuti) a seconda dei gruppi di soggetti. 600 g di uova liofilizzate marcate con 2H saranno ottenute da galline ovaiole a cui è stata somministrata per via orale una miscela uniforme di AA marcata con 2H per 60 giorni con il loro mangime quotidiano. Verranno eseguite analisi microbiologiche per garantirne la sicurezza per il consumo umano.

18 volontari saranno inclusi alla fine dello studio e testati presso il Centro di ricerca sulla nutrizione umana dell'Ospedale di Avicenne (Francia). I principali criteri di inclusione sono uomini e donne, di età compresa tra 18 e 45 anni, indice di massa corporea (BMI) da 18 a 30 kg/m2. I principali criteri di esclusione sono qualsiasi patologia digestiva o epatica, allergia alle uova, allergia al lattice, donne incinte. A causa della procedura invasiva di intubazione, i ricercatori prevedono di reclutare 30 volontari per far fronte al consueto 40% di abbandoni.

I soggetti saranno divisi in 3 gruppi da n=6:

• Bolus-spi, n = 6, i volontari consumeranno il pasto di prova come bolo in una volta a t = 0, con 13C-spirulina come proteina di riferimento
• Plateau-spi, n = 6, i volontari consumeranno il pasto di prova in un protocollo di alimentazione plateau, con 13C-spirulina come proteina di riferimento
• Plateau-AA, n = 6, i volontari consumeranno il pasto di prova in un protocollo di alimentazione plateau, con la miscela di AA priva di 13C come "proteina" di riferimento

Una settimana prima dell'esperimento, i volontari seguiranno una dieta standard adattata al loro peso corporeo per controllare l'apporto proteico (1,3 g di proteine/kg di peso corporeo).

I volontari arriveranno al Centro di ricerca sulla nutrizione umana dell'ospedale di Avicenne la mattina prima del giorno dell'esperimento. Saranno dotati di un tubo intestinale a triplo lume che potrà progredire attraverso il tratto intestinale per 24 ore. Uno dei lumi è radioopaco e serve a perfondere un produttore non assorbibile nell'intestino (metodo con marcatore lento). Il secondo lume è dedicato al gonfiaggio di un palloncino zavorrato che facilita la migrazione del tubo. Il terzo lume è dedicato all'aspirazione continua degli effluenti, 15 cm sotto il sito di perfusione. La misurazione del marcatore non assorbibile negli effluenti consente la determinazione della portata dell'effluente.

Il giorno dell'esperimento, la posizione del tubo verrà controllata mediante radiografia per verificarne la posizione nell'ileo terminale. Verrà inserito un catetere nella vena dell'avambraccio per il prelievo di sangue. La perfusione del marcatore non assorbibile, polietilenglicole (PEG) 4000 (20 g/l), inizierà a una velocità di flusso di 1 ml/min. Il flusso intestinale e il campione ileale basale verranno raccolti durante 30 minuti. Verranno raccolti campioni basali di plasma e urina.

A t = 0, i volontari del gruppo "Bolus-spi" consumeranno tutto il pasto-test in meno di 20 min. Per i volontari dei gruppi "Plateau-spi" e "Plateau-AA", il pasto-prova sarà suddiviso in 22 porzioni uguali e consumeranno il primo pasto come dose iniziale di 6 mini-porzioni. Successivamente consumeranno mini porzioni singole ogni 30 minuti per 7,5 ore. Una parte sarà dedicata all'analisi dei pasti. Fino a t = 8, il contenuto intestinale verrà raccolto continuamente mediante aspirazione e riunito ogni 30 minuti. Il sangue verrà prelevato ogni ora per 4 ore e ogni 30 minuti da t = 5 a t = 8. L'urina verrà raccolta ogni 2 ore fino a t=8 (il volume totale della produzione di urina verrà annotato in ogni momento per un raggruppamento proporzionale). I campioni di respiro verranno raccolti ogni 30 minuti. La produzione di anidride carbonica (VCO2) sarà valutata ogni ora per 10 minuti mediante calorimetria indiretta (Canopy). Il campione di urina verrà raccolto all'inizio dell'esperimento e durante il protocollo di studio. I campioni fecali verranno raccolti prima dell'inizio dell'esperimento ed entro le successive 24 ore. Il tubo naso-ileale verrà rimosso dopo l'ultima raccolta di effluente a t = 8. Il tubo naso-ileale verrà rimosso dopo l'ultima raccolta di effluente a t = 8.

Verranno effettuate le seguenti analisi:

• Concentrazione di PEG-4000 mediante metodo turbidimetrico nei campioni di digestione
• Contenuto totale di idrogeno e arricchimento di 2H nei campioni di pasti e digesti mediante spettrometria di massa a rapporto isotopico (IRMS) accoppiato all'analizzatore di pirolisi
• Contenuto di carbonio totale e arricchimento di 13C nei campioni di pasti e digesti mediante analizzatore elementare (EA) accoppiato a IRMS
• Concentrazione di AA nei campioni di pasti e digesti mediante cromatografia liquida ad altissima prestazione (UHPLC)
• Campioni di plasma e farina di arricchimento con 13C-AA e 2H-AA mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)
• Arricchimento di 13C-AA e 2H-AA in campioni di digestione e farina mediante gascromatografia-combustione-spettrometria di massa del rapporto isotopico (GC-C-IRMS)
• Contenuto di celite in campioni di digestione raggruppati (0-8 ore).
• 13CO2 nel campione di respiro mediante Multiflow-IRMS
• Aminoacidomo e peptidoma di campioni digestivo, plasma, urina e feci

Parte delle analisi (plasma e farina di arricchimento con 13C-AA e 2H-AA mediante LC-MS/MS, analisi -omiche) saranno eseguite dai nostri collaboratori del St John's Research Institute di Bangalore (India).