Validação do método de isótopos duplos para medir a digestibilidade da proteína ileal (VALDIM)

A refeição de teste consistirá em 60 g de ovo em pó inteiro liofilizado que contém 30 g de proteína de ovo 2H e 800 mg de [U-13C]-espirulina ou 400 mg de mistura de AA livre de 13C, misturada com água e cozida como uma omelete. O ovo em pó 2H foi produzido pelos nossos colaboradores do St John's Research Institute em Bangalore (Índia). Celite (cinza insolúvel em ácido, Advanced Minerals Corporation) será adicionada à refeição como um marcador indigestível para verificar a recuperação da refeição nos efluentes. A refeição teste será dada em bolus ou em platô (mini-refeições repetidas) dependendo dos grupos de sujeitos. 600 g de ovos liofilizados marcados com 2H serão obtidos de galinhas poedeiras que receberam uma mistura AA uniformemente marcada com 2H por via oral por 60 dias com sua alimentação diária. Serão realizadas análises microbiológicas para garantir sua segurança para consumo humano.

18 voluntários serão incluídos ao final do estudo e testados no Centro de Pesquisa em Nutrição Humana do Hospital Avicenne (França). Os principais critérios de inclusão são homens e mulheres, de 18 a 45 anos, índice de massa corporal (IMC) de 18 a 30 kg/m2. Os principais critérios de exclusão são qualquer patologia digestiva ou hepática, alergia a ovos, alergia a látex, mulheres grávidas. Devido ao procedimento invasivo de intubação, os investigadores planejam recrutar 30 voluntários para acomodar os habituais 40% de abandonos.

Os sujeitos serão divididos em 3 grupos de n = 6:

• Bolus-spi, n = 6, os voluntários consumirão a refeição teste em bolus de uma só vez em t = 0, tendo 13C-spirulina como proteína de referência
• Plateau-spi, n = 6, os voluntários consumirão a refeição teste em protocolo de alimentação platô, tendo 13C-spirulina como proteína de referência
• Platô-AA, n = 6, os voluntários consumirão a refeição teste em protocolo de alimentação platô, com mistura de AA livre de 13C como "proteína" de referência

Uma semana antes do experimento, os voluntários seguirão uma dieta padrão adaptada ao peso corporal para controlar a ingestão de proteínas (1,3 g de proteína/kg de peso corporal).

Os voluntários chegarão ao Centro de Pesquisa em Nutrição Humana do Hospital Avicenne na manhã anterior ao dia do experimento. Eles serão equipados com um tubo intestinal de triplo lúmen que poderá progredir pelo trato intestinal por 24 horas. Um dos lúmens é radiopaco e serve para perfundir um marcador não absorvível no intestino (método de marcador lento). O segundo lúmen é dedicado a inflar um balão com peso que facilita a migração do tubo. O terceiro lúmen é dedicado à aspiração contínua dos efluentes, 15 cm abaixo do local de perfusão. A medição do marcador não absorvível nos efluentes permite a determinação da vazão do efluente.

No dia do experimento, a posição do tubo será verificada por radiografia para verificar sua localização no íleo terminal. Um cateter será inserido na veia do antebraço para coleta de sangue. A perfusão do marcador não absorvível, polietilenoglicol (PEG) 4000 (20 g/l), começará com vazão de 1 ml/min. O fluxo intestinal e a amostra basal ileal serão coletados durante 30 min. Serão coletadas amostras de plasma basal e urina.

Em t = 0, os voluntários do grupo “Bolus-spi” consumirão toda a refeição teste em menos de 20 min. Para os voluntários dos grupos “Plateau-spi” e “Plateau-AA”, a refeição teste será dividida em 22 porções iguais e consumirão a primeira refeição como dose inicial de 6 miniporções. Em seguida, consumirão miniporções únicas a cada 30 minutos durante 7,5 horas. Uma parte será dedicada às análises das refeições. Até t = 8, o conteúdo intestinal será coletado continuamente por aspiração e agrupado a cada 30 min. O sangue será coletado de hora em hora durante 4 horas e a cada 30 minutos de t = 5 a t = 8. A urina será coletada a cada 2 horas até t = 8 (o volume total de produção de urina será anotado em cada ponto de tempo para agrupamento proporcional). Amostras respiratórias serão coletadas a cada 30 minutos. A produção de dióxido de carbono (VCO2) será avaliada de hora em hora durante 10 min por calorimetria indireta (Canopy). A amostra de urina será coletada no início do experimento e durante o protocolo do estudo. Amostras fecais serão coletadas antes do início do experimento e nas próximas 24 horas. O tubo naso-ileal será retirado após a última coleta de efluente em t=8. O tubo naso-ileal será retirado após a última coleta de efluente em t=8.

Serão realizadas as seguintes análises:

• Concentração de PEG-4000 pelo método turbidimétrico em amostras de digesta
• Teor de hidrogênio total e enriquecimento de 2H em amostras de farinhas e digesta por espectrometria de massa de razão isotópica (IRMS) acoplada a analisador de pirólise
• Teor de carbono total e enriquecimento de 13C em amostras de farinhas e digesta por analisador Elemental (EA) acoplado ao IRMS
• Concentração de AA em amostras de farinhas e digesta por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC)
• Amostras de plasma e farinha de enriquecimento 13C-AA e 2H-AA por Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa em tandem (LC-MS/MS)
• Enriquecimento de 13C-AA e 2H-AA em amostras de digesta e farinha por espectrometria de massa de cromatografia gasosa-combustão-isótopo (GC-C-IRMS)
• Conteúdo de celite em amostras de digesta agrupadas (0-8 h)
• 13CO2 em amostra respiratória por Multiflow-IRMS
• Aminoacidoma e peptidoma de amostras de digesta, plasma, urina e fezes

Parte das análises (plasma e farinha de enriquecimento de 13C-AA e 2H-AA por LC-MS/MS, análises -ômicas) serão feitas por nossos colaboradores do St John's Research Institute em Bangalore (Índia).