Walidacja dwuizotopowej metody pomiaru strawności białka jelita krętego (VALDIM)

Posiłek testowy będzie się składał z 60 g liofilizowanego proszku z całych jaj, który zawiera 30 g białka jaja 2H i 800 mg [U-13C]-spiruliny lub 400 mg mieszanki 13C wolnej AA, zmieszanej z wodą i ugotowanej w formie omletu. Proszek jajeczny 2H został wyprodukowany przez naszych współpracowników z Instytutu Badawczego St John's w Bangalore (Indie). Celit (popiół nierozpuszczalny w kwasie, Advanced Minerals Corporation) zostanie dodany do mączki jako niestrawny marker w celu sprawdzenia odzysku mączki ze ściekami. Posiłek testowy będzie podawany jako bolus lub w formie plateau (powtarzane miniposiłki), w zależności od grupy pacjentów. 600 g liofilizowanych jaj znakowanych 2H otrzyma się od kur niosek, którym codziennie przez 60 dni podawano doustnie równomiernie znakowaną mieszankę AA znakowaną 2H. Zostaną przeprowadzone analizy mikrobiologiczne w celu zapewnienia ich bezpieczeństwa do spożycia przez ludzi.

Na koniec badania zostanie włączonych 18 ochotników, którzy zostaną poddani testom w Centrum Badań nad Żywieniem Człowieka w szpitalu w Avicenne (Francja). Głównymi kryteriami włączenia są mężczyźni i kobiety w wieku od 18 do 45 lat, ze wskaźnikiem masy ciała (BMI) od 18 do 30 kg/m2. Głównymi kryteriami wykluczenia są wszelkie patologie układu trawiennego lub wątroby, alergia na jaja, alergia na lateks, kobiety w ciąży. Ze względu na inwazyjną procedurę intubacji badacze planują zatrudnić 30 ochotników, aby uwzględnić zwyczajową liczbę 40% osób, które przedwcześnie przerywają badanie.

Badani zostaną podzieleni na 3 grupy po n = 6:

• Bolus-spi, n = 6, ochotnicy spożyją posiłek testowy jako bolus jednorazowo w t = 0, z 13C-spiruliną jako białkiem referencyjnym
• Plateau-spi, n = 6, ochotnicy spożywają posiłek testowy zgodnie z protokołem żywienia na płaskowyżu, ze spiruliną 13C jako białkiem referencyjnym
• Plateau-AA, n = 6, ochotnicy będą spożywać posiłek testowy zgodnie z protokołem żywienia na płaskowyżu, z mieszaniną AA niezawierającą 13C jako „białko” odniesienia

Na tydzień przed eksperymentem ochotnicy będą stosować standardową dietę dostosowaną do ich masy ciała, aby kontrolować spożycie białka (1,3 g białka/kg masy ciała).

Ochotnicy przybędą do Centrum Badań nad Żywieniem Człowieka w szpitalu w Avicenne rano w dniu poprzedzającym dzień eksperymentu. Zostaną wyposażone w rurkę jelitową o potrójnym świetle, która będzie mogła przechodzić przez przewód pokarmowy przez 24 godziny. Jedno ze świateł jest nieprzezroczyste dla promieni rentgenowskich i służy do perfuzji niewchłanialnego czynnika w jelicie (metoda powolnego markera). Drugi prześwit przeznaczony jest do nadmuchania obciążonego balonu, który ułatwia migrację rurki. Trzeci prześwit przeznaczony jest do ciągłego zasysania ścieków, 15 cm poniżej miejsca perfuzji. Pomiar niewchłanialnego znacznika w ściekach pozwala na określenie natężenia przepływu ścieków.

W dniu badania położenie rurki zostanie sprawdzone radiologicznie w celu sprawdzenia jej umiejscowienia w końcowym odcinku jelita krętego. Do żyły przedramienia zostanie wprowadzony cewnik w celu pobrania krwi. Perfuzja niewchłanialnego markera, glikolu polietylenowego (PEG) 4000 (20 g/l), rozpoczyna się przy szybkości przepływu 1 ml/min. Wypływ jelitowy i próbkę podstawy jelita krętego będą pobierane w ciągu 30 minut. Zostaną pobrane podstawowe próbki osocza i moczu.

W t = 0 ochotnicy z grupy „Bolus-spi” skonsumują cały posiłek testowy w czasie krótszym niż 20 minut. W przypadku ochotników z grup „Plateau-spi” i „Plateau-AA” posiłek testowy zostanie podzielony na 22 równe porcje i pierwszy posiłek będą spożywać jako dawkę podstawową składającą się z 6 miniporcji. Następnie będą spożywać pojedyncze miniporcje co 30 min przez 7,5 godz. Jedna część będzie poświęcona analizie posiłków. Do t = 8 treść jelitowa będzie w sposób ciągły zbierana poprzez aspirację i gromadzona co 30 minut. Próbki krwi będą pobierane co godzinę przez 4 godziny i co 30 minut od t = 5 do t = 8. Mocz będzie zbierany co 2 godziny aż do t=8 (całkowita objętość wydalanego moczu będzie odnotowywana w każdym punkcie czasowym w celu proporcjonalnego gromadzenia). Próbki oddechu będą pobierane co 30 minut. Wydzielany dwutlenek węgla (VCO2) będzie oceniany co godzinę przez 10 minut za pomocą kalorymetrii pośredniej (Canopy). Próbka moczu zostanie pobrana na początku doświadczenia i podczas protokołu badania. Próbki kału zostaną pobrane przed rozpoczęciem doświadczenia oraz w ciągu najbliższych 24 godzin. Rurka nosowo-jelitowa zostanie usunięta po ostatnim pobraniu wycieku w t = 8. Rurka nosowo-jelitowa zostanie usunięta po ostatnim pobraniu wycieku w t = 8.

Zostaną wykonane następujące analizy:

• Stężenie PEG-4000 metodą turbidymetryczną w próbkach trawiennych
• Całkowita zawartość wodoru i wzbogacenie w 2H w mączkach i próbkach trawiennych metodą spektrometrii mas ze stosunkiem izotopów (IRMS) w połączeniu z analizatorem pirolizy
• Całkowita zawartość węgla i wzbogacenie w 13C w mączkach i próbkach trawiennych za pomocą analizatora elementarnego (EA) sprzężonego z IRMS
• Stężenie AA w mączkach i próbkach trawiennych metodą ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC)
• Próbki osocza i mączki wzbogacane w 13C-AA i 2H-AA metodą chromatografii cieczowej w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)
• Wzbogacanie 13C-AA i 2H-AA w próbkach treści pokarmowej i mączce metodą chromatografii gazowej, spalania i spektrometrii masowej stosunku izotopów (GC-C-IRMS)
• Zawartość celitu w zbiorczych (0-8 h) próbkach trawienia
• 13CO2 w próbce oddechu według Multiflow-IRMS
• Aminokwasy i peptydomy w próbkach treści pokarmowej, osocza, moczu i kału

Część analiz (osocze i mączka wzbogacona w 13C-AA i 2H-AA metodą LC-MS/MS, analizy -omiczne) zostaną wykonane przez naszych współpracowników z Instytutu Badawczego St John's w Bangalore (Indie).