회장 단백질 소화율 측정을 위한 이중 동위원소 방법의 검증 (VALDIM)

테스트 식사는 2H 계란 단백질 30g과 [U-13C]-스피루리나 800mg 또는 13C 유리 AA 혼합물 400mg을 포함하는 동결 건조된 전란 분말 60g으로 구성되며, 물과 혼합되어 오믈렛으로 조리됩니다. 2H 계란 분말은 방갈로르(인도)에 있는 St John's Research Institute의 협력자들에 의해 생산되었습니다. 셀라이트(산불용성 재, Advanced Minerals Corporation)는 폐수에서 식사의 회복을 확인하기 위해 소화불량 지표로 식사에 추가됩니다. 시험 식사는 피험자 그룹에 따라 볼루스 또는 고원 급식(반복 미니 식사)으로 제공됩니다. 매일 사료와 함께 60일 동안 균일하게 2H 라벨이 붙은 AA 혼합물을 경구 투여한 산란계로부터 600g의 2H 라벨 동결건조 계란을 얻을 수 있습니다. 인간이 섭취할 수 있는 안전성을 보장하기 위해 미생물학적 분석이 수행됩니다.

연구 종료 시 18명의 지원자가 포함되어 프랑스 Avicenne 병원의 인간 영양 연구 센터에서 테스트를 받게 됩니다. 주요 포함 기준은 남성과 여성, 18~45세, 체질량지수(BMI) 18~30kg/m2입니다. 주요 제외 기준은 소화기 또는 간 병리, 계란에 대한 알레르기, 라텍스에 대한 알레르기, 임산부입니다. 삽관의 침습적 절차로 인해 조사관은 일반적으로 40%의 중퇴자를 수용하기 위해 30명의 지원자를 모집할 계획입니다.

피험자는 n = 6의 3개 그룹으로 나뉩니다.

• Bolus-spi, n = 6, 지원자는 t = 0에서 한 번에 시험 식사를 볼루스로 섭취하고 13C-스피루리나를 참조 단백질로 사용합니다.
• Plateau-spi, n = 6, 자원 봉사자들은 13C-스피루리나를 기준 단백질로 하여 고원 급식 프로토콜로 테스트 식사를 섭취합니다.
• Plateau-AA, n = 6, 지원자는 참조 "단백질"로 13C가 없는 AA 혼합물을 사용하여 고원 급식 프로토콜로 테스트 식사를 섭취합니다.

실험 일주일 전, 지원자들은 단백질 섭취량을 조절하기 위해 체중에 맞는 표준 식단을 따릅니다(1.3g 단백질/kg 체중).

자원봉사자들은 실험 전날 오전에 아비센 병원 인간영양연구센터에 도착할 예정이다. 그들은 24시간 동안 장관을 통해 진행할 수 있는 삼중 루멘 장 튜브를 갖추고 있습니다. 내강 중 하나는 방사선 불투과성이며 장에 비흡수성 메이커를 관류시키는 역할을 합니다(느린 마커 방법). 두 번째 루멘은 튜브의 이동을 촉진하는 가중 풍선을 팽창시키는 데 사용됩니다. 세 번째 루멘은 관류 부위 아래 15cm에서 폐수의 지속적인 흡입을 담당합니다. 폐수에서 비흡수성 표지를 측정하면 폐수 유속을 결정할 수 있습니다.

실험 당일 튜브의 위치를 ​​방사선 촬영으로 확인하여 회장 말단에서의 위치를 ​​확인합니다. 혈액 채취를 위해 팔뚝 정맥에 카테터를 삽입합니다. 비흡수성 마커인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 4000(20g/l)의 관류는 1ml/분의 유속으로 시작됩니다. 장 흐름과 기초 회장 샘플은 30분 동안 수집됩니다. 기초 혈장 및 소변 샘플이 수집됩니다.

t = 0에서 "Bolus-spi" 그룹의 지원자는 20분 이내에 모든 테스트 식사를 소비합니다. "Plateau-spi" 및 "Plateau-AA" 그룹의 지원자의 경우 테스트 식사는 22개의 동일한 부분으로 나누어지며 첫 번째 식사는 6개의 미니 부분의 프라이밍 용량으로 섭취됩니다. 그런 다음 7.5시간 동안 30분마다 단일 미니 부분을 소비합니다. 한 부분은 식사 분석에 전념합니다. t = 8까지 장 콘텐츠는 흡인을 통해 지속적으로 수집되고 30분마다 풀링됩니다. 혈액은 4시간 동안 매시간, t = 5부터 t = 8까지 30분마다 샘플링됩니다. 소변은 t=8까지 2시간마다 수집됩니다(비례 통합을 위해 각 시점에서 소변 배출량의 총량이 기록됩니다). 호흡 샘플은 30분마다 수집됩니다. 이산화탄소 출력(VCO2)은 간접 열량측정법(Canopy)을 통해 10분 동안 매시간 평가됩니다. 소변 샘플은 실험 시작 시와 연구 프로토콜 중에 수집됩니다. 배설물 샘플은 실험 시작 전과 다음 24시간 이내에 수집됩니다. 비회장관은 t = 8에서 마지막 폐수 수집 후 제거됩니다. 비회장관은 t=8에서 마지막 폐수 수집 후 제거됩니다.

다음 분석이 수행됩니다.

• 소화물 샘플에서 탁도법을 통한 PEG-4000의 농도
• 열분해 분석기와 결합된 동위원소 비율 질량 분석기(IRMS)를 통해 식사 및 소화물 샘플의 총 수소 함량 및 2H 농축
• IRMS와 결합된 원소 분석기(EA)를 통한 식사 및 소화 샘플의 총 탄소 함량 및 13C 농축
• 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)를 통한 식사 및 소화 샘플 내 AA 농도
• 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피를 통한 13C-AA 및 2H-AA 농축 혈장 및 식사 샘플
• 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GC-C-IRMS)을 통한 소화물 및 식사 시료의 13C-AA 및 2H-AA 농축
• 풀링된(0~8시간) 소화물 샘플의 셀라이트 함량
• Multiflow-IRMS를 통한 호흡 샘플의 13CO2
• 소화물, 혈장, 소변 및 대변 샘플의 아미노산 및 펩티돔

분석의 일부(LC-MS/MS에 의한 13C-AA 및 2H-AA 농축 혈장 및 식사, -omic 분석)는 방갈로르(인도)에 있는 St John's Research Institute의 공동 작업자가 수행합니다.