Validación del método de isótopos duales para medir la digestibilidad de la proteína ileal (VALDIM)

La comida de prueba consistirá en 60 g de huevo entero liofilizado en polvo que contiene 30 g de proteína de huevo 2H y 800 mg de espirulina [U-13C] o 400 mg de una mezcla de AA libre de 13C, mezclado con agua y cocinado en forma de tortilla. El huevo 2H en polvo ha sido producido por nuestros colaboradores del Instituto de Investigación St John's de Bangalore (India). Se agregará celita (ceniza insoluble en ácido, Advanced Minerals Corporation) a la harina como marcador no digerible para comprobar la recuperación de la harina en los efluentes. La comida de prueba se administrará en forma de bolo o en una alimentación meseta (minicomidas repetidas) según los grupos de sujetos. Se obtendrán 600 g de huevos liofilizados marcados con 2H a partir de gallinas ponedoras a las que se les administró una mezcla de AA uniformemente marcada con 2H por vía oral durante 60 días con su alimento diario. Se realizarán análisis microbiológicos para garantizar su seguridad para el consumo humano.

Se incluirán 18 voluntarios al final del estudio y se evaluarán en el Centro de Investigación en Nutrición Humana del Hospital Avicenne (Francia). Los principales criterios de inclusión son hombres y mujeres, de 18 a 45 años, índice de masa corporal (IMC) de 18 a 30 kg/m2. Los principales criterios de exclusión son cualquier patología digestiva o hepática, alergia al huevo, alergia al látex, mujeres embarazadas. Debido al procedimiento invasivo de intubación, los investigadores planean reclutar a 30 voluntarios para dar cabida a los abandonos habituales del 40%.

Los sujetos se dividirán en 3 grupos de n = 6:

• Bolus-spi, n = 6, los voluntarios consumirán la comida de prueba como un bolo de una vez en t = 0, con 13C-spirulina como proteína de referencia.
• Plateau-spi, n = 6, los voluntarios consumirán la comida de prueba en un protocolo de alimentación de meseta, con 13C-spirulina como proteína de referencia.
• Plateau-AA, n = 6, los voluntarios consumirán la comida de prueba en un protocolo de alimentación de meseta, con una mezcla de AA sin 13C como "proteína" de referencia.

Una semana antes del experimento, los voluntarios seguirán una dieta estándar adaptada a su peso corporal para controlar su ingesta proteica (1,3 g de proteína/kg de peso corporal).

Los voluntarios llegarán al Centro de Investigación en Nutrición Humana del Hospital Avicenne la mañana anterior al día del experimento. Estarán equipados con un tubo intestinal de triple luz que se permitirá avanzar a través del tracto intestinal durante 24 h. Una de las luces es radioopaca y sirve para perfundir un agente no absorbible en el intestino (método de marcador lento). El segundo lumen está dedicado a inflar un globo con peso que facilita la migración del tubo. El tercer lumen está dedicado a la aspiración continua de los efluentes, 15 cm por debajo del lugar de perfusión. La medición del marcador no absorbible en los efluentes permite determinar el caudal del efluente.

El día del experimento, se comprobará mediante radiografía la posición del tubo para verificar su ubicación en el íleon terminal. Se insertará un catéter en la vena del antebrazo para tomar muestras de sangre. La perfusión del marcador no absorbible, polietilenglicol (PEG) 4000 (20 g/l), comenzará con un caudal de 1 ml/min. El flujo intestinal y la muestra ileal basal se recolectarán durante 30 min. Se recolectarán muestras basales de plasma y orina.

En t = 0, los voluntarios del grupo "Bolus-spi" consumirán toda la comida de prueba en menos de 20 min. Para los voluntarios de los grupos "Plateau-spi" y "Plateau-AA", la comida de prueba se dividirá en 22 porciones iguales y consumirán la primera comida como una dosis preparatoria de 6 miniporciones. Luego, consumirán miniporciones individuales cada 30 min durante 7,5 h. Una parte se dedicará a los análisis de las comidas. Hasta t = 8, el contenido intestinal se recogerá continuamente mediante aspiración y se combinará cada 30 min. Se tomarán muestras de sangre cada hora durante 4 h y cada 30 min desde t = 5 hasta t = 8. La orina se recolectará cada 2 h hasta t = 8 (el volumen total de producción de orina se anotará en cada momento para la combinación proporcional). Se recolectarán muestras de aliento cada 30 minutos. La producción de dióxido de carbono (VCO2) se evaluará cada hora durante 10 min mediante calorimetría indirecta (Canopy). Se recolectará una muestra de orina al inicio del experimento y durante el protocolo del estudio. Se recolectarán muestras fecales antes del inicio del experimento y dentro de las próximas 24 h. La sonda nasoileal se retirará después de la última recolección de efluente en t = 8. La sonda nasoileal se retirará después de la última recolección de efluente en t = 8.

Se realizarán los siguientes análisis:

• Concentración de PEG-4000 por método turbidimétrico en muestras de digesta.
• Contenido de hidrógeno total y enriquecimiento de 2H en comidas y muestras de digesto mediante espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS) acoplada a un analizador de pirólisis
• Contenido de carbono total y enriquecimiento de 13C en comidas y muestras de digesto mediante analizador elemental (EA) acoplado a IRMS
• Concentración de AA en muestras de harinas y digestos mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC)
• Muestras de harina y plasma enriquecidas con 13C-AA y 2H-AA mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)
• Enriquecimiento con 13C-AA y 2H-AA en muestras de digesto y harina mediante cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas con relación de isótopos (GC-C-IRMS)
• Contenido de celita en muestras de digesta agrupadas (0-8 h)
• 13CO2 en muestra de aliento mediante Multiflow-IRMS
• Aminoacidoma y peptidoma de muestras de digesto, plasma, orina y heces.

Parte de los análisis (plasma enriquecido con 13C-AA y 2H-AA y harina mediante LC-MS/MS, análisis -ómicos) serán realizados por nuestros colaboradores del St John's Research Institute en Bangalore (India).