Validierung der Dual-Isotopen-Methode zur Messung der Verdaulichkeit von Ilealproteinen (VALDIM)

Die Testmahlzeit besteht aus 60 g lyophilisiertem Volleipulver, das 30 g 2H-Eiprotein und 800 mg [U-13C]-Spirulina oder 400 mg einer 13C-freien AA-Mischung enthält, mit Wasser vermischt und als Omelett gekocht. Das 2H-Ei-Pulver wurde von unseren Mitarbeitern des St. John's Research Institute in Bangalore (Indien) hergestellt. Celite (säureunlösliche Asche, Advanced Minerals Corporation) wird dem Mehl als unverdaulicher Marker zugesetzt, um die Rückgewinnung des Mehls im Abwasser zu überprüfen. Die Testmahlzeit wird je nach Probandengruppe als Bolus oder in einer Plateaufütterung (wiederholte Minimahlzeiten) verabreicht. 600 g 2H-markierte lyophilisierte Eier werden von Legehennen gewonnen, denen 60 Tage lang oral mit ihrem täglichen Futter eine einheitlich 2H-markierte AA-Mischung verabreicht wurde. Um ihre Sicherheit für den menschlichen Verzehr sicherzustellen, werden mikrobiologische Analysen durchgeführt.

18 Freiwillige werden am Ende der Studie einbezogen und im Human Nutrition Research Center des Avicenne Hospital (Frankreich) getestet. Die Haupteinschlusskriterien sind Männer und Frauen im Alter von 18 bis 45 Jahren mit einem Body-Mass-Index (BMI) von 18 bis 30 kg/m2. Die wichtigsten Ausschlusskriterien sind Verdauungs- oder Lebererkrankungen, Allergien gegen Eier, Allergien gegen Latex und schwangere Frauen. Aufgrund des invasiven Intubationsverfahrens planen die Forscher die Rekrutierung von 30 Freiwilligen, um den üblichen 40 % der Studienabbrecher Rechnung zu tragen.

Die Probanden werden in 3 Gruppen zu je n = 6 eingeteilt:

• Bolus-spi, n = 6, die Freiwilligen nehmen die Testmahlzeit als Bolus auf einmal zum Zeitpunkt t = 0 zu sich, mit 13C-Spirulina als Referenzprotein
• Plateau-spi, n = 6, die Freiwilligen werden die Testmahlzeit in einem Plateau-Fütterungsprotokoll mit 13C-Spirulina als Referenzprotein verzehren
• Plateau-AA, n = 6, die Freiwilligen werden die Testmahlzeit im Rahmen eines Plateau-Fütterungsprotokolls verzehren, mit einer 13C-freien AA-Mischung als Referenz-„Protein“.

Eine Woche vor dem Experiment befolgen die Freiwilligen eine an ihr Körpergewicht angepasste Standarddiät, um ihre Proteinaufnahme zu kontrollieren (1,3 g Protein/kg Körpergewicht).

Die Freiwilligen werden am Morgen vor dem Tag des Experiments im Human Nutrition Research Center des Avicenne Hospital eintreffen. Sie werden mit einem dreilumigen Darmschlauch ausgestattet, der 24 Stunden lang durch den Darmtrakt wandern kann. Eines der Lumen ist strahlenundurchlässig und dient der Perfusion eines nicht resorbierbaren Stoffes im Darm (langsame Markermethode). Das zweite Lumen dient zum Aufblasen eines gewichteten Ballons, der die Bewegung des Schlauchs erleichtert. Das dritte Lumen dient dem kontinuierlichen Absaugen der Abflüsse, 15 cm unterhalb der Perfusionsstelle. Die Messung des nicht resorbierbaren Markers im Abwasser ermöglicht die Bestimmung der Abwasserflussrate.

Am Tag des Experiments wird die Position des Schlauchs durch Röntgenaufnahmen überprüft, um seine Lage am terminalen Ileum zu verifizieren. Zur Blutentnahme wird ein Katheter in die Unterarmvene eingeführt. Die Perfusion des nicht resorbierbaren Markers Polyethylenglykol (PEG) 4000 (20 g/l) beginnt mit einer Flussrate von 1 ml/min. Der Darmfluss und die basale Ileumprobe werden 30 Minuten lang gesammelt. Es werden Basalplasma- und Urinproben entnommen.

Bei t = 0 werden die Freiwilligen der Gruppe „Bolus-spi“ die gesamte Testmahlzeit in weniger als 20 Minuten verzehren. Für die Freiwilligen der Gruppen „Plateau-spi“ und „Plateau-AA“ wird die Testmahlzeit in 22 gleiche Portionen aufgeteilt und sie nehmen die erste Mahlzeit als Grunddosis von 6 Miniportionen zu sich. Anschließend verzehren sie 7,5 Stunden lang alle 30 Minuten einzelne Miniportionen. Ein Teil ist der Analyse von Mahlzeiten gewidmet. Bis t = 8 wird der Darminhalt kontinuierlich durch Absaugen gesammelt und alle 30 Minuten gepoolt. Die Blutentnahme erfolgt stündlich während 4 Stunden und alle 30 Minuten von t = 5 bis t = 8. Bis t=8 wird alle 2 Stunden Urin gesammelt (das Gesamtvolumen der Urinausscheidung wird zu jedem Zeitpunkt für die proportionale Zusammenführung notiert). Alle 30 Minuten werden Atemproben entnommen. Der Kohlendioxidausstoß (VCO2) wird stündlich während 10 Minuten durch indirekte Kalorimetrie (Canopy) bewertet. Zu Beginn des Experiments und während des Studienprotokolls wird eine Urinprobe entnommen. Stuhlproben werden vor Beginn des Experiments und innerhalb der nächsten 24 Stunden gesammelt. Der Naso-Ileal-Schlauch wird nach der letzten Sammlung des Abwassers zum Zeitpunkt t = 8 entfernt. Der Naso-Ileal-Schlauch wird nach der letzten Sammlung des Abwassers zum Zeitpunkt t = 8 entfernt.

Folgende Analysen werden durchgeführt:

• Konzentration von PEG-4000 mittels turbidimetrischer Methode in Digesta-Proben
• Gesamtwasserstoffgehalt und 2H-Anreicherung in Mahlzeiten und Digestaproben mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) gekoppelt mit einem Pyrolyseanalysator
• Gesamtkohlenstoffgehalt und 13C-Anreicherung in Mahlzeiten und Digestaproben mittels Elementaranalysator (EA), gekoppelt an IRMS
• AA-Konzentration in Mahlzeiten und Verdauungsproben mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC)
• 13C-AA- und 2H-AA-Anreicherungsplasma- und Mahlzeitproben durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)
• 13C-AA- und 2H-AA-Anreicherung in Digesta- und Mehlproben mittels Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-C-IRMS)
• Celite-Gehalt in gepoolten (0–8 h) Digesta-Proben
• 13CO2 in der Atemprobe durch Multiflow-IRMS
• Aminoazidom und Peptidom von Digesta-, Plasma-, Urin- und Stuhlproben

Ein Teil der Analysen (13C-AA- und 2H-AA-Anreicherungsplasma und -mehl mittels LC-MS/MS, -omic-Analysen) wird von unseren Mitarbeitern des St. John's Research Institute in Bangalore (Indien) durchgeführt.