Валидация двухизотопного метода измерения усвояемости белка подвздошной кишки (VALDIM)

Тестовая еда будет состоять из 60 г лиофилизированного цельного яичного порошка, содержащего 30 г яичного белка 2H и 800 мг [U-13C]-спирулины или 400 мг смеси АК, не содержащей 13C, смешанного с водой и приготовленного в виде омлета. Яичный порошок 2H был произведен нашими сотрудниками из Научно-исследовательского института Святого Иоанна в Бангалоре (Индия). Целит (нерастворимая в кислоте зола, Advanced Minerals Corporation) будет добавлен в шрот в качестве неперевариваемого маркера для проверки восстановления шрота в сточных водах. Тестовый прием пищи будет даваться болюсно или в виде плато (повторяющихся мини-приемов) в зависимости от группы субъектов. 600 г лиофилизированных яиц, меченных 2H, получают от кур-несушек, которым перорально в течение 60 дней с ежедневным кормом равномерно вводят смесь АК, меченную 2H. Будут проведены микробиологические анализы, чтобы гарантировать их безопасность для потребления человеком.

По окончании исследования 18 добровольцев будут включены в исследование и протестированы в Исследовательском центре питания человека больницы Авицен (Франция). Основными критериями включения являются мужчины и женщины в возрасте от 18 до 45 лет, индекс массы тела (ИМТ) от 18 до 30 кг/м2. Основными критериями исключения являются любые патологии пищеварения или печени, аллергия на яйца, аллергия на латекс, беременные женщины. Из-за инвазивной процедуры интубации исследователи планируют набрать 30 добровольцев, чтобы учесть обычные 40% выбывших.

Субъекты будут разделены на 3 группы по n = 6 человек:

• Болюс-спи, n = 6, добровольцы будут употреблять тестовую еду в виде болюса за один раз в t = 0, с 13C-спирулиной в качестве эталонного белка.
• Плато-spi, n = 6, добровольцы будут потреблять тестовую еду по протоколу плато с использованием 13C-спирулины в качестве эталонного белка.
• Плато-АА, n = 6, добровольцы будут потреблять тестовую еду по протоколу плато, используя смесь АК, не содержащую 13С, в качестве эталонного «белка».

За неделю до эксперимента добровольцы будут соблюдать стандартную диету, адаптированную к их массе тела, чтобы контролировать потребление белка (1,3 г белка на кг массы тела).

Добровольцы прибудут в Исследовательский центр питания человека больницы Авиценны утром накануне дня эксперимента. Они будут оснащены трехпросветной кишечной трубкой, которая позволит продвигаться по кишечному тракту в течение 24 часов. Один из просветов рентгеноконтрастен и служит для перфузии нерассасывающегося продуцента в кишечнике (метод медленных маркеров). Второй просвет предназначен для надувания утяжеленного баллона, который облегчает перемещение трубки. Третий просвет предназначен для непрерывной аспирации выделений, на 15 см ниже места перфузии. Измерение неабсорбируемого маркера в сточных водах позволяет определить скорость потока сточных вод.

В день эксперимента положение трубки будет проверено с помощью рентгенографии, чтобы подтвердить ее расположение в терминальном отделе подвздошной кишки. В вену предплечья введут катетер для забора крови. Перфузия неабсорбируемого маркера полиэтиленгликоля (ПЭГ) 4000 (20 г/л) начинается со скоростью потока 1 мл/мин. Кишечный поток и базальный образец подвздошной кишки будут собраны в течение 30 минут. Будут взяты базальные образцы плазмы и мочи.

При t = 0 добровольцы группы «Болюс-спи» съедят весь тестовый обед менее чем за 20 мин. Для добровольцев групп «Плато-спи» и «Плато-АА» тестовый прием пищи будет разделен на 22 равные порции, и первый прием пищи они будут употреблять в качестве стартовой дозы из 6 мини-порций. Затем они будут потреблять отдельные мини-порции каждые 30 минут в течение 7,5 часов. Одна часть будет посвящена анализу еды. До момента t = 8 содержимое кишечника будет непрерывно собираться путем аспирации и объединяться каждые 30 минут. Кровь будут брать ежечасно в течение 4 часов и каждые 30 минут с t = 5 до t = 8. Моча будет собираться каждые 2 часа до t=8 (общий объем выделяемой мочи будет отмечаться в каждый момент времени для пропорционального объединения). Пробы дыхания будут собираться каждые 30 минут. Выход углекислого газа (VCO2) будет оцениваться ежечасно в течение 10 минут методом непрямой калориметрии (Canopy). Образец мочи будет собран в начале эксперимента и во время протокола исследования. Образцы фекалий будут собраны до начала эксперимента и в течение следующих 24 часов. Назо-подвздошная трубка будет удалена после последнего сбора выделений при t = 8. Назо-подвздошная трубка будет удалена после последнего сбора выделений при t = 8.

Будут проведены следующие анализы:

• Концентрация ПЭГ-4000 турбидиметрическим методом в пробах дигеста.
• Общее содержание водорода и обогащение 2H в пробах пищевых продуктов и пищевого продукта с помощью масс-спектрометрии изотопного соотношения (IRMS) в сочетании с анализатором пиролиза.
• Общее содержание углерода и обогащение 13C в пробах пищевых продуктов и пищеварения с помощью элементного анализатора (ЭА), соединенного с IRMS.
• Концентрация АК в пищевых продуктах и ​​образцах дигеста с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ)
• Образцы плазмы и муки, обогащенные 13C-AA и 2H-AA, с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС)
• Обогащение 13C-AA и 2H-AA в образцах дигеста и муки методом газовой хроматографии, масс-спектрометрии соотношения изотопов горения (GC-C-IRMS)
• Содержание целита в объединенных (0-8 ч) пробах дигесты
• 13CO2 в пробе дыхания Multiflow-IRMS
• Аминоацидом и пептидом образцов дигеста, плазмы, мочи и кала

Часть анализов (плазма и мука с обогащением 13C-AA и 2H-AA методом ЖХ-МС/МС, -омный анализ) будут выполнены нашими сотрудниками из Научно-исследовательского института Святого Иоанна в Бангалоре (Индия).