Validation de la méthode à double isotope pour mesurer la digestibilité des protéines iléales (VALDIM)

Le repas test sera composé de 60 g de poudre d'œuf entier lyophilisée contenant 30 g de protéine d'œuf 2H et 800 mg de [U-13C]-spiruline ou 400 mg de mélange AA libre de 13C, mélangés à de l'eau et cuits en omelette. La poudre d'œuf 2H a été produite par nos collaborateurs du St John's Research Institute de Bangalore (Inde). De la célite (cendres insolubles dans l'acide, Advanced Minerals Corporation) sera ajoutée à la farine comme marqueur indigeste pour vérifier la récupération de la farine dans les effluents. Le repas test sera administré en bolus ou en alimentation plateau (mini-repas répétés) selon les groupes de sujets. 600 g d'œufs lyophilisés marqués au 2H seront obtenus à partir de poules pondeuses ayant reçu un mélange AA uniformément marqué au 2H par voie orale pendant 60 jours avec leur alimentation quotidienne. Des analyses microbiologiques seront effectuées pour garantir leur innocuité pour la consommation humaine.

18 volontaires seront inclus à la fin de l'étude et testés au Centre de Recherche en Nutrition Humaine de l'Hôpital Avicenne (France). Les principaux critères d'inclusion sont les hommes et les femmes, âgés de 18 à 45 ans, avec un indice de masse corporelle (IMC) compris entre 18 et 30 kg/m2. Les principaux critères d'exclusion sont toute pathologie digestive ou hépatique, l'allergie aux œufs, l'allergie au latex, la femme enceinte. En raison de la procédure invasive d'intubation, les enquêteurs prévoient de recruter 30 volontaires pour accueillir les 40 % d'abandons habituels.

Les matières seront réparties en 3 groupes de n = 6 :

• Bolus-spi, n = 6, les volontaires consommeront le repas test sous forme de bolus en une seule fois à t = 0, avec la spiruline 13C comme protéine de référence
• Plateau-spi, n = 6, les volontaires consommeront le repas test selon un protocole d'alimentation en plateau, avec la spiruline 13C comme protéine de référence
• Plateau-AA, n = 6, les volontaires consommeront le repas test selon un protocole d'alimentation en plateau, avec un mélange AA sans 13C comme « protéine » de référence

Une semaine avant l'expérimentation, les volontaires suivront un régime alimentaire standard adapté à leur poids corporel pour contrôler leur apport en protéines (1,3 g de protéines/kg de poids corporel).

Les volontaires arriveront au Centre de Recherche en Nutrition Humaine de l'Hôpital Avicenne la veille du jour de l'expérimentation. Ils seront équipés d'un tube intestinal à triple lumière qui pourra progresser dans le tractus intestinal pendant 24 h. L'une des lumières est radio-opaque et sert à perfuser un agent non résorbable dans l'intestin (méthode du marqueur lent). La deuxième lumière est dédiée au gonflement d'un ballon lesté qui facilite la migration du tube. La troisième lumière est dédiée à l'aspiration continue des effluents, 15 cm sous le site de perfusion. La mesure du marqueur non résorbable dans les effluents permet de déterminer le débit des effluents.

Le jour de l'expérience, la position du tube sera vérifiée par radiographie pour vérifier sa localisation au niveau de l'iléon terminal. Un cathéter sera inséré dans la veine de l'avant-bras pour un prélèvement sanguin. La perfusion du marqueur non résorbable, le polyéthylène glycol (PEG) 4000 (20 g/l), débutera à un débit de 1 ml/min. Le flux intestinal et l'échantillon iléal basal seront collectés pendant 30 min. Un échantillon basal de plasma et d'urine sera collecté.

A t = 0, les volontaires du groupe « Bolus-spi » consommeront tout le repas-test en moins de 20 min. Pour les volontaires des groupes « Plateau-spi » et « Plateau-AA », le repas-test sera divisé en 22 portions égales et ils consommeront le premier repas sous forme d'une dose d'amorçage de 6 mini-portions. Ensuite, ils consommeront des mini-portions uniques toutes les 30 minutes pendant 7,5 heures. Une partie sera dédiée aux analyses des repas. Jusqu'à t = 8, le contenu intestinal sera collecté en continu par aspiration et regroupé toutes les 30 min. Le sang sera prélevé toutes les heures pendant 4 h et toutes les 30 min de t = 5 à t = 8. L'urine sera collectée toutes les 2 h jusqu'à t = 8 (le volume total de production d'urine sera noté à chaque instant pour une mise en commun proportionnelle). Des échantillons d'haleine seront collectés toutes les 30 minutes. La production de dioxyde de carbone (VCO2) sera évaluée toutes les heures pendant 10 min par calorimétrie indirecte (Canopy). Un échantillon d'urine sera collecté au début de l'expérience et pendant le protocole d'étude. Des échantillons fécaux seront collectés avant le début de l'expérience et dans les 24 heures suivantes. La sonde naso-iléale sera retirée après la dernière collecte d'effluent à t = 8. La sonde naso-iléale sera retirée après la dernière collecte d'effluent à t = 8.

Les analyses suivantes seront effectuées :

• Concentration de PEG-4000 par méthode turbidimétrique dans les échantillons de digesta
• Teneur en hydrogène total et enrichissement en 2H des échantillons de repas et de digesta par spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS) couplée à un analyseur de pyrolyse
• Teneur en carbone total et enrichissement en 13C des échantillons de repas et de digesta par analyseur élémentaire (EA) couplé à l'IRMS
• Concentration d'AA dans les repas et les échantillons de digesta par Chromatographie Liquide Ultra Haute Performance (UHPLC)
• Échantillons de plasma et de repas enrichis en 13C-AA et 2H-AA par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)
• Enrichissement en 13C-AA et 2H-AA dans les échantillons de digesta et de farine par chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse à rapport isotopique (GC-C-IRMS)
• Teneur en célite dans des échantillons de digesta regroupés (0-8 h)
• 13CO2 dans un échantillon d'haleine par Multiflow-IRMS
• Amino-acide et peptidome des échantillons de digesta, de plasma, d'urine et de matières fécales

Une partie des analyses (plasma et repas d'enrichissement en 13C-AA et 2H-AA par LC-MS/MS, analyses -omiques) seront réalisées par nos collaborateurs du St John's Research Institute de Bangalore (Inde).